血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在實(shí)驗(yàn)性大鼠慢性中耳炎中耳粘膜組織中的表達(dá)

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(西安710004)

王延輝 許 珉 田 鵬

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞高特異性的有絲分裂原,具有提高血管對(duì)血漿蛋白滲透性的能力,可參與多種炎性疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)慢性中耳炎大鼠中耳粘膜組織VEGF的表達(dá)進(jìn)行了觀察,并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了半定量分析,為研究 VEGF在慢性中耳炎炎癥中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑與設(shè)備 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心健康成年SD大鼠 25只,體重220～250g,Preyer反射靈敏,耳鏡檢查正常;羊抗大鼠V EGF單克隆抗體,DAB顯色盒,S-P試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);光學(xué)顯微鏡;1×108L-1金黃色葡萄球菌液由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供。

2 大鼠慢性中耳炎模型建立 25只大鼠均以右耳為實(shí)驗(yàn)耳,左耳作正常對(duì)照,大鼠用速眠新(0.2～0.3ml)肌肉注射麻醉后,無(wú)菌條件下于右耳經(jīng)鼓膜注射 1×108L-1的金葡菌液 100μl,左耳注入100μl無(wú)菌生理鹽水作為正常對(duì)照。在清潔安靜的飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng),觀察期間未給大鼠進(jìn)行任何治療。注射滿(mǎn)1月后處死。大鼠麻醉后,開(kāi)胸經(jīng)左心室行升主動(dòng)脈穿刺,生理鹽水快速灌注沖出血液,再用多聚甲醛,戊二醛快速低溫灌注后,緩慢滴注1h,取出并剪開(kāi)雙側(cè)聽(tīng)泡,置4℃冰箱2d,充分水洗,10%EDTA脫鈣2周。按常規(guī)石蠟定向包埋。

3 染色方法 水平位連續(xù)切片,隔5～7片取 1片鋪片。2張用于HE染色,5張用于VEGF免疫組化染色。免疫組化染色采用S-P法,嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,DAB顯色后,切片脫水透明,中性樹(shù)脂封片。空白對(duì)照組用 PBS代替一抗,結(jié)果為陰性。陽(yáng)性對(duì)照采用試劑盒自帶切片。

4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 光鏡觀察 VEGF表達(dá)部位與表達(dá)程度,鏡下被染成棕色的部位為陽(yáng)性表達(dá),深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),棕黃色或淺棕色為陰性,采用半定量計(jì)分法衡量染色強(qiáng)度:陰性記0分,弱陽(yáng)性染色記1分,中等染色記 2分,強(qiáng)染色記 3分。在同等條件及400倍鏡下,每張切片均選取不相重疊的5個(gè)代表部位,分別衡量粘膜上皮細(xì)胞的染色強(qiáng)度,將 5個(gè)值平均后所得值為該標(biāo)本測(cè)量結(jié)果。將大鼠中耳粘膜病變程度根據(jù)HE染色分為3級(jí):Ⅰ級(jí):鼓室粘膜和粘膜下組織水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn),粘膜杯狀上皮細(xì)胞胞核深染,并見(jiàn)新生的小血管組織、成纖維細(xì)胞,未見(jiàn)鈣化。Ⅱ級(jí):中耳粘膜上皮下結(jié)締組織見(jiàn)均質(zhì)紅染的玻璃樣變,纖維組織增生,壞死組織中發(fā)生鈣化。Ⅲ級(jí):鈣化的范圍進(jìn)一步擴(kuò)大,玻璃樣變物質(zhì)減少,其周?chē)?jiàn)大量纖維組織增生,修復(fù)的纖維層方向紊亂,成骨細(xì)胞增生,可見(jiàn)新生的骨組織。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,表達(dá)量的差異用成組設(shè)計(jì)兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn),等級(jí)資料的差異用秩和檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05(雙側(cè)),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 手術(shù)顯微鏡下觀察鼓膜及中耳 大鼠空白對(duì)照耳(n=25)見(jiàn)鼓膜光滑透亮,富含血管紋的錘骨柄清晰可見(jiàn),鼓室內(nèi)粘膜呈淡粉紅色,聽(tīng)泡骨壁薄而光滑,未見(jiàn)鈣化。實(shí)驗(yàn)耳中5耳見(jiàn)鼓膜稍充血,透過(guò)鼓膜可見(jiàn)鼓室內(nèi)少許黃色滲液。其余20耳均出現(xiàn)鼓膜穿孔,殘留鼓膜略充血。聽(tīng)泡骨壁增厚粗糙,鼓室內(nèi)見(jiàn)大量淡黃色粘稠分泌物,用棉拭子將分泌物擦拭干凈后,鼓室粘膜充血水腫,明顯增厚。其中2耳鼓室腔可見(jiàn)鈣化斑。

2 免疫組化染色結(jié)果 正常大鼠中耳粘膜VEGF表達(dá)較弱,主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和膠原基質(zhì)。慢性中耳炎大鼠中耳粘膜存在彌漫性強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),VEGF陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞胞漿,胞核無(wú)著色,陽(yáng)性細(xì)胞聚集成團(tuán),排列密集。免疫浸潤(rùn)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)。用SPSS軟件配對(duì)t檢驗(yàn),t=25.50,二者有明顯差異(P＜0.05)。隨著炎癥程度的增加,VEGF在中耳粘膜中陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度增加,進(jìn)一步作兩兩比較發(fā)現(xiàn)不同級(jí)別之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(兩兩組間比 P均＜0.05)。

表1 VEGF在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中耳粘膜中表達(dá)

表2 VEGF在實(shí)驗(yàn)組中耳粘膜中表達(dá)

討 論

研究慢性中耳炎發(fā)病機(jī)制,尤其是細(xì)胞因子在慢性中耳炎中的作用,已成為研究熱點(diǎn)[1～3]。但是由于臨床操作上的局限性,在人體內(nèi)難以檢測(cè)細(xì)胞因子在中耳炎表達(dá)的過(guò)程。比較解剖學(xué)的研究結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中,大鼠的中耳解剖結(jié)構(gòu)與人的最為相似,本研究從組織學(xué)上證明了已成功建立了大鼠慢性中耳炎的模型。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是一種特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子,有誘導(dǎo)血管生成,增加血管通透性等作用。VEGF可增加血管通透,主要是對(duì)毛細(xì)血管后靜脈和小靜脈施以影響。VEGF增加血管通透性的作用十分強(qiáng)烈,效應(yīng)是組織胺作用濃度的5萬(wàn)倍[4]。目前認(rèn)為:(1)炎癥誘導(dǎo) VECF的表達(dá),從而導(dǎo)致微血管的生長(zhǎng)。(2)另一些學(xué)者證實(shí)VEGF通過(guò)合成血小板活化因子影響血管通透性,從而加重炎癥的滲出。另一方面,VEGF誘導(dǎo)加強(qiáng)炎癥反應(yīng)[5]。

在中耳炎大鼠粘膜組織中VEGF的表達(dá)增強(qiáng),而且部分炎細(xì)胞也參與合成和分泌,表明V EGF可能也參與組織的局部免疫反應(yīng)。VEGF以自分泌和旁分泌方式特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)囊泡器的功能發(fā)揮對(duì)毛細(xì)血管和小靜脈的特異性通透作用,這種作用極利于大分子物質(zhì)如纖維蛋白原的通過(guò),隨后發(fā)生的血漿外滲致細(xì)胞外基質(zhì)增加,使中耳粘膜發(fā)生水腫。VEGF和炎癥程度的關(guān)系:隨著炎性程度的增加,VEGF的表達(dá)值有逐漸增加的趨勢(shì),I、II、III級(jí) VEGF的表達(dá)值之間差異有顯著性。顯示VEGF表達(dá)強(qiáng)度與中耳炎癥程度相關(guān)。

血管的改建是慢性炎癥的一個(gè)特征,血管生成有助于受損組織的修復(fù),但持續(xù)異常的血管生成卻又促使炎癥遷延不愈。血漿持續(xù)外滲,細(xì)胞因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和炎性細(xì)胞的長(zhǎng)期存在均不利于受損組織的修復(fù)。此外,促血管形成的相關(guān)因子大多與成纖維細(xì)胞有關(guān),這些因子長(zhǎng)期大量的產(chǎn)生會(huì)致使受損粘膜過(guò)度纖維化。而肉芽組織乃由旺盛增生的毛細(xì)血管及纖維結(jié)締組織和各種炎性細(xì)胞組成。張全安等[6]研究發(fā)現(xiàn)中耳肉芽組織是由潴留滲出液逐步轉(zhuǎn)變而來(lái)的,是中耳腔慢性滲出液長(zhǎng)期積存的結(jié)果。所以推測(cè)VEGF在炎癥期促進(jìn)肉芽組織的形成。

綜上所述,中耳炎發(fā)病機(jī)制是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程,它同時(shí)有多種因素起作用,這些因素之間又存在相互關(guān)系,而新生血管形成在這其中起了重要作用。深入研究VEGF與慢性中耳炎的關(guān)系,有助于進(jìn)一步了解其發(fā)病機(jī)制,并為中耳炎的治療提供一種新的可能途徑。

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