神經(jīng)生長因子對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究*

昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院整形外科(昆明 650032)

袁瑞紅 劉 流△ 趙德萍▲ 徐宏慧 孫家平 王福科 劉 垠

病理性瘢痕在臨床上發(fā)病率有上升的趨勢(shì),隨著人們生活質(zhì)量的提高,越來越受到人們的重視。目前比較一致的看法是瘢痕疙瘩是一個(gè)復(fù)雜的病變,與許多基因相關(guān)[1,2]。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞之間的相互作用和真皮成纖維細(xì)胞在調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)瘢痕形成中發(fā)揮重要作用,瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是相同的過程中的兩個(gè)不同階段[3,4]。近年的大量研究已表明,創(chuàng)傷部位細(xì)胞的多樣性和合成活性由各種生長因子調(diào)節(jié),即生長因子參與了創(chuàng)傷修復(fù)的調(diào)控過程。生長因子大量釋放,迅速擴(kuò)散,并被蛋白酶降解,新的生長因子又從趨化而來的細(xì)胞中合成,另外,細(xì)胞間基質(zhì)也影響生長因子的作用,影響其溶解性及儲(chǔ)存。因此,在創(chuàng)傷修復(fù)的一系列過程中,生長因子起著關(guān)鍵性的作用。神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor,NGF)可由多種細(xì)胞分泌合成,如炎性細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞等,其生物學(xué)作用具有多樣性,均與創(chuàng)傷修復(fù)過程有密切關(guān)系,但其作用機(jī)制尚不明了。我們通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究了NGF對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康 Sprague-Dawley(SD)大鼠 4只,雌雄各半,體重300±10g。

2 方 法 ①動(dòng)物分組:將4只SD大鼠隨機(jī)分為NGF組(n=2)及空白對(duì)照組(n=2),每組又隨機(jī)分為7d、10d兩個(gè)時(shí)間組(n=1)。②動(dòng)物模型:用 3%戊巴比妥鈉以 0.1ml/100g體重行腹腔注射麻醉,將鼠背剪毛,無菌條件下在鼠背部沿脊柱兩側(cè)各作三個(gè)直徑 1.5cm的圓形全厚皮膚缺損,建立大鼠全厚皮膚缺損模型。實(shí)驗(yàn)側(cè)沿創(chuàng)面基底注射NGF(0.33μg/ml),對(duì)照側(cè)注射無菌生理鹽水,劑量均為0.5ml,每天注射1次,設(shè)空白對(duì)照,不用任何藥物。分別于手術(shù)后7d、10d處死各組動(dòng)物,取材。③標(biāo)本病理染色:中性甲醛液固定組織,酒精梯度脫水,透明,石蠟包埋,石蠟切片,厚度 3～5μm。行 HE染色、Cason氏改良三色染色(此法系Mallory氏染色法的改良,染色效果與Mallory氏染色法基本一致)、Hamason-Lushbangh氏染色(此法特點(diǎn)是利用銀溶液和其它多種染料將網(wǎng)狀纖維、膠原纖維和彈力纖維分別顯示出來,故又稱為三種纖維的聯(lián)合染色,染色效果較好)。④標(biāo)本電鏡觀察:LKB-Ⅴ型切片機(jī)切片后檸檬酸鉛-醋酸鈾雙染色,JEM-100CX透射電鏡觀察、攝片、記錄。

結(jié) 果

1 動(dòng)物模型標(biāo)本病理染色觀察 對(duì)照組:7d組,膠原纖維排列疏松,平行排列,其間見少許成纖維細(xì)胞和少許微血管,皮膚附屬器消失。10d組更明顯(圖1,3)。NGF組:7d組,膠原纖維排列紊亂,沉積較少,其間見大量成纖維細(xì)胞和部分新生微血管,真皮內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤;10d組膠原纖維沉積增加,炎性細(xì)胞浸潤減少,其它改變不明顯(圖2,4)。

圖1 對(duì)照組 7d:膠原纖維平行于表皮排列,微血管數(shù)量減少,表皮增厚(LM×40)

圖2 NGF組7d:表皮層增厚,膠原纖維排列紊亂,真皮 內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤,微血管數(shù)量增多(LM×40)

圖3 對(duì)照組 10d:大量膠原纖維沉積,排列紊亂,上皮釘突消失,上皮層增厚(LM×40)

圖4 NGF組 10d:膠原纖維增多,排列紊亂,炎性細(xì)胞浸潤少見,微血管豐富(LM×200)

2 動(dòng)物模型標(biāo)本超微結(jié)構(gòu)觀察 空白對(duì)照組:7d組表皮未見明顯異常,皮下結(jié)締組織,膠原纖維排列致密,其間見較多毛細(xì)血管,膠原纖維間見少許成纖維細(xì)胞,且胞質(zhì)欠豐富,部分成纖維細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張;10d組可見膠原纖維間較多梭形纖維細(xì)胞,胞質(zhì)少,胞質(zhì)內(nèi)見少許粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體,部分線粒體腫脹嵴溶解。NGF組:7d組,上皮下見大量成纖維細(xì)胞,細(xì)胞胞質(zhì)豐富,胞質(zhì)內(nèi)見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,膠原纖維排列較疏松;10d組,膠原纖維排列較疏松,其間見較多成纖維細(xì)胞,成纖維細(xì)胞胞質(zhì)豐富,胞質(zhì)內(nèi)見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯,局部見部分纖維細(xì)胞,纖維細(xì)胞呈梭形,胞質(zhì)內(nèi)見少許粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),局部見炎性細(xì)胞。

討 論

機(jī)體軟組織受創(chuàng)后,首先發(fā)生的是局部炎癥反應(yīng),在這一過程中中性白細(xì)胞浸潤,單核細(xì)胞參與組織碎片移出,繼而出現(xiàn)肌纖維母細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、血管母細(xì)胞以及膠原等成分的增生,局部血運(yùn)增加等病理生理反應(yīng),在這一系列變化中,NGF可以起一定的調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用,如果將 NGF注入到鼠背部的皮下創(chuàng)面,可以觀察到不同種類的炎癥細(xì)胞在組織受損部位的聚合顯著增加,首先是多形核白細(xì)胞,其次為單核細(xì)胞,再其次為成纖維細(xì)胞。NGF趨化和促進(jìn)創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)和每一種細(xì)胞聚集峰值的大小與注入NGF的濃度呈正比。實(shí)驗(yàn)表明,增生性瘢痕中存在NGF的異常高水平表達(dá),且 NGF創(chuàng)面上皮化后仍可趨化、活化炎性細(xì)胞,并促進(jìn)其增殖及脫顆粒。因此推測(cè),增生性瘢痕內(nèi)異常高水平的NGF能通過趨化、活化炎性細(xì)胞而啟動(dòng)病理性膠原代謝。

有實(shí)驗(yàn)表明,羊膜基底有大量的神經(jīng)生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β1和神經(jīng)生長因子受體的表達(dá)。此外,除了神經(jīng)生長因子的存在,可以大大增加TGF-β1的產(chǎn)生和釋放[5]。現(xiàn)在有學(xué)者提出“神經(jīng)源性炎癥假說”,即過度的神經(jīng)生長因子可誘導(dǎo)感覺纖維過度釋放神經(jīng)肽,從而導(dǎo)致神經(jīng)肽的積累,即使在沒有機(jī)械應(yīng)力的作用下,仍然能導(dǎo)致瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的形成[6]。神經(jīng)生長因子在治療不同原因造成的潰瘍(角膜潰瘍、褥瘡、病毒感染、化學(xué)燒傷)時(shí),可能縮短恢復(fù)進(jìn)程,是因神經(jīng)生長因子和(或)神經(jīng)營養(yǎng)因子不同時(shí)間過程的受體(NGRF)/大鼠 p75(非編碼區(qū))的表達(dá),可能調(diào)節(jié)最后進(jìn)程。因此,神經(jīng)生長因子的潛在親愈合能力可能調(diào)節(jié)愈合過程中的一些病理變化[7]。局部應(yīng)用神經(jīng)生長因子可改善韌帶愈合促進(jìn)再生和血管生成,并導(dǎo)致瘢痕增強(qiáng)韌帶的力學(xué)性能[8]。在心梗瘢痕愈合的研究中顯示,受損的疤痕在的地塞米松治療愈合后,衰減的瘢痕肌成纖維細(xì)胞增殖及神經(jīng)生長因子的表達(dá),有助于減少梗塞區(qū)域的神經(jīng)反應(yīng)[9]。有學(xué)者應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究顯示,在瘢痕疙瘩與正常皮膚中,有高表達(dá)的轉(zhuǎn)化生長因子-β(1)和神經(jīng)生長因子[10]。

大鼠標(biāo)本病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果示,7d時(shí),瘢痕組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤,膠原纖維排列紊亂,其間血管豐富,10d時(shí),炎性細(xì)胞浸潤減少,膠原纖維形成較多,排列紊亂。標(biāo)本電鏡觀察結(jié)果顯示,兩個(gè)時(shí)間段瘢痕組織內(nèi)見大量成纖維細(xì)胞,細(xì)胞胞質(zhì)豐富,見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯。以上結(jié)果顯示,在創(chuàng)傷修復(fù)過程中,NGF促進(jìn)了炎癥細(xì)胞的聚集,同時(shí)還促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的增殖,從而促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合,但過量應(yīng)用也將導(dǎo)致病理性瘢痕的形成。

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