測定維生素A含量的兩種方法比較

黃成安　張喜金　李斌

[摘要] 目的 通過比較測定維生素A含量的兩種不同方法，為維生素A及其制劑的含量測定提供參考，從而建立一種快速、準確、簡單的檢測方法。 方法 均采用高效液相色譜法測定，沸水浴回流皂化法采用甲醇-水（94∶6）為流動相，檢測波長為300nm，色譜柱溫度為40℃；加熱超聲法采用甲醇-水（98∶2）為流動相，檢測波長為325nm，色譜柱溫度為40℃。 結果 通過檢測，兩種方法所得出的含量相差較小，相對誤差均在1.0%之內。 結論 兩種測定方法均科學有效，能對湯臣倍健維生素A維生素D軟膠囊（兒童型）中維生素A的含量起到質量控制的目的。方法2更為快捷簡單，溶劑使用量少，能夠節省檢驗成本，提高人員利用率。

[關鍵詞] 高效液相色譜法；維生素A；方法比較

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2015）01-103-04

[Abstract] Objective Through the comparison of two different methods for the determination of vitamin A content，provides the reference for the content determination of vitamin A and its preparation，and to establish a rapid，accurate，simple detection method. Methods All by HPLC，using methanol water boiling water bath reflux saponification method （94：6） as mobile phase，the detection wavelength was 300nm，column temperature was 40℃；using methanol water heating and ultrasonic method （98：2） as mobile phase，the detection wavelength was 325nm，column temperature was 40℃. Results By detecting the content of two kinds of methods，the less difference，relative error is within 1%. Conclusion Two analysis methods are scientific and effective，vitamin A vitamin D soft capsules（for children） content of vitamin A to the purpose of quality control. Methods 2 is more simple，less solvent consumption，can save the test cost，improve the utilization rate.

[Key words] HPLC；Vitamin A；Comparison of methods

維生素A（圖1）可促進視覺細胞內感光色素的形成，調試眼睛適應外界光線強弱的能力，以降低夜盲癥和視力減退的發生，維持正常的視覺反應。而維生素A攝入過量也會引起副作用，可損害腦組織等，因此維生素A制劑含量的控制十分重要[1-3]。由于維生素A的不穩定性，放置不當或放置時間過長均易導致其變質，故選擇一種快捷簡單、結果可靠、專屬性強、靈敏度高、成本低廉的測定方法，顯得尤為重要[4-5]。

維生素A在分類中屬于脂溶性維生素，能夠調節人體的多種生理機能，增強機體免疫能力，在調節體內各方面的代謝及促進骨骼的生長發育上有著極其重要的作用，同時它也參與視網膜視紫質的合成與再生，維持正常視覺[6-7]。維生素A主要存在于動物肝臟、血液和眼球的視網膜中，又叫視黃醇。為黃至帶紅色的橙黃色液體，冷凍后可固化，有異臭，耐光和耐氧性弱，易被脂肪氧化酶分解[8-9]。不溶于水和甘油，混溶于氯仿、乙醚和脂肪。

1 儀器、對照品與試劑

維生素A醋酸酯對照品（DR，30112，純度：98.8%）；維生素A視黃醇對照品（SIGMA，BCBG2044V，純度：98%）；甲醇（AR級）；95%乙醇（AR級）；乙醚（AR級）；氫氧化鉀（AR級）；抗壞血酸（AR級）；甲醇（HPLC級）；蒸餾水。

超聲波清洗器（EQ-500）；高效液相色譜儀（島津-15C）；TB-215D型電子分析天平；AL-204型電子分析天平；EMS-50型磁力攪拌水浴鍋；R-202旋轉蒸發器。

2 結果

2.1 方法1

色譜條件：色譜柱：CNW Athena C18-WP（5μm，150mm×4.6mm）；以甲醇-水（94：6）為流動相；流速為1.0mL/min；柱溫：40℃；檢測波長為300nm。

對照品溶液的制備：精密稱取維生素A對照品5.67mg至50mL容量瓶，并用95%乙醇溶解定容至50mL，搖勻即得，作為標準儲備母液。精密稱取芘內標物32.18mg至500mL容量瓶，并用95%乙醇溶解定容至刻度，搖勻即得內標溶液。精密量取1mL維生素A視黃醇對照品儲備母液至50mL容量瓶，加95%乙醇溶解并定容，以95%乙醇為空白，在325nm波長處測定其吸光度。按C=A/1835÷100×1 000 000計算，其中C是濃度（單位為μg/mL），A是平均吸光度，1835是吸光系數，100是%系數轉換因子，1 000 000是單位轉換系數。精密吸取對照品溶液0.5、1、2、3、5mL置于25mL容量瓶中，精密加入內標溶液3mL，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得5個不同濃度的對照品溶液，濃度為2.00272μg/mL，4.00544μg/mL，8.01088μg/mL，12.01632μg/mL，20.02720μg/mL。

供試品溶液的制備 取3個不同批號的湯臣倍健維生素A維生素D軟膠囊（兒童型），分別編號為1、2、3。各取20粒樣品，擠出內容物，攪拌均勻后精密稱取試樣約0.075g于250mL三角瓶中，用95%乙醇約50mL使其溶解，直到顆粒物分散均勻為止。加入10%抗壞血酸水溶液5mL、3mL芘內標液、10mL氫氧化鉀水溶液（1∶1），混勻。于沸水浴回流60min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷卻。用50mL的水分兩次將皂化液全部轉入500mL分液漏斗中，加入100mL乙醚，輕輕搖動，排氣后蓋好瓶塞，室溫下振蕩約10min后靜置分層，將水相轉入另一500mL分液漏斗中，按上述方法進行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通過無水硫酸鈉過濾脫水，濾液收入500mL圓底燒瓶中，于旋轉蒸發儀上在（50±2）℃充氮條件下蒸至近干（絕不允許蒸干）。殘渣精密加入95%乙醇25mL，超聲波提取溶解，過濾，即得。

2.1.1 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.1.2 標準曲線 按上述色譜條件測定。

2.2 方法2

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ACCHROM Unitary C18（2.8μm，150mm×4.6mm）；以甲醇-水（98：2）為流動相；流速為1.0mL/min；柱溫：40℃；檢測波長為325nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 稱取維生素A醋酸酯對照品5.51mg到50mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲使其溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為標準儲備母液。精確量取5mL標準儲備母液到50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45μm的濾膜，即得。

2.2.3供試品溶液的制備 分別取編號為1、2、3的樣品，擠出內容物，攪拌均勻后精密稱取試樣約0.55g置于25mL容量瓶中，加甲醇適量，于50～55℃超聲，并不時振搖樣品，30min后取出，冷卻，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，過0.45μm的濾膜，即得。

2.2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液2μL、5μL、10μL、25μL、40μL與供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.5 標準曲線 按上述色譜條件測定，所測峰面積見表3。

經檢測，兩種方法得出的含量均在規定范圍之內（50.00～83.25mg/100g），方法1為國家標準GB/T 5009.82-2003所使用的方法，通過驗證兩種不同的檢驗方法，所測出的維生素A的含量相差較小，相對誤差均在1.0%之內，證明兩種測定方法均科學有效，能對湯臣倍健維生素A維生素D軟膠囊（兒童型）中維生素A的含量起到質量控制的目的。而方法2的對照品配制方法、樣品處理方法更為快捷簡單，耗用時間短，溶劑使用量少，能夠節省檢驗成本，提高人員利用率，更為適合本企業。

3 討論

由于維生素A性質不穩定，分析時間長會造成維生素A分解，故應盡量縮短分析時間。經過紫外光譜測定，在該色譜條件下，維生素A在325nm波長處有最大吸收，因此方法2中選擇325nm作為檢測波長；流動相中甲醇與水的比例經過試驗，當比例為（94∶6）時樣品中維生素A與內標物的分離較好，且維生素A保留時間適中，故方法1選用該比例進行測定；在方法1中，當使用乙醚進行萃取后靜置，有部分樣品會出現乳化現象。當出現該現象時，往分液漏斗中加入適量純化水或者95%乙醇，即可消除該現象。

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（收稿日期：2014-10-21）