解偶聯蛋白2在PM2.5致心肌細胞損傷中作用機制的初步探討

鄭貴浪　吳家興

[摘要] 目的 初步探討解偶聯蛋白2（UCP2）在PM2.5致心肌細胞損傷中的作用。 方法 培養大鼠心肌細胞株H9C2細胞，給予siRNA和（或）PM2.5刺激，48h后檢查肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH），RT-PCR及Western Blot檢測UCP2基因轉錄及蛋白水平，比色法檢測線粒體的活性氧（ROS）和ATP酶的活性。 結果 與PM2.5組相比，PM2.5+siRNA組心肌細胞CK和LDH明顯升高（969±21 vs 747±29U/mL，1071±59 vs 877±47U/L），ATP酶活性下降明顯（24.7±4.7 vs 40.2±4.9U/mgprot），細胞內ROS明顯增多（90.2±6.2 vs 69.2±6.3U/Well），差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 PM2.5可以導致UCP2基因表達代償性增多及心肌細胞損傷；RNA干擾沉默UCP2基因，會導致心肌損傷進一步加重；提示UCP2在PM2.5致心肌損傷過程中可能起著保護作用。

[關鍵詞] 解偶聯蛋白2；PM2.5；H9C2；心肌細胞；線粒體；活性氧；ATP

[中圖分類號] R730.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）01-40-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of UCP2 during the injury procedure of PM2.5 on the rat myocardial cells H9C2. Methods Rat cardiomyocytes H9C2 cell lines were cultured， after 48 hours of given PM2.5 and （or） siRNA stimulus， creatine kinase （CK） and lactate dehydrogenase （LDH） were detected. The expession of UCP2 in transcription and translation levels was detected by RT-PCR and Western Blot respectively. Mitochondrial reactive oxygen species （ROS） and ATP enzyme activity were determinated by colorimetric detection. Results Compared with the PM2.5 group， CK and LDH were elevated （969±21 vs 747±29 U/mL，1071±59 vs 877±47 U/L）， ATP activity decreased （24.7±4.7 vs 40.2±4.9 U/mgprot）， intracellular ROS increased （90.2±6.2 vs 69.2±6.3 U/Well） in the PM2.5+siRNA group. And the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion PM2.5 can lead to myocardial cell damage and increased expression of UCP2 gene， and the silence of UCP2 by RNAi lead to aggravating injury of H9C2 cells， indicating that UCP2 may play an protective effect during the injury procedure of H9C2 caused by PM2.5.

[Key words] UCP2； PM2.5； H9C2； Myocardial cells； Mitochondria； ROS； ATP

近年來，大氣污染備受關注，其中顆粒物是城市大氣污染的重要物質。根據粒徑大小可將其分為空氣動力學直徑介于2.5～10μm粗顆粒物（PM10）和空氣動力學直徑小于2.5μm的細顆粒物（PM2.5）。PM2.5與人體健康關系最密切。PM2.5化學成分復雜，包括無機成分、有機成分、微量重金屬元素、元素碳等，主要來自于人類活動如工業生產及交通運輸工具尾氣排放、工業生產及取暖的燃燒釋放、吸煙的煙霧釋放等[1]。

動物試驗及臨床流行病學調查顯示，PM2.5與

人類心血管疾病有密切關系。PM2.5可促進心肌細胞變性和間質細胞增生，進而導致以心肌間質纖維化為主要表現的心肌重構[2-3]；可以通過氧化應激反應損傷血管黏膜，引起血管通透性及血液黏度增加，加速主動脈和冠狀動脈粥樣硬化和斑塊破裂過程[4-5]；可以誘發心律失常、心肌缺血甚至心跳聚停等[6-7]。我們前期研究也表明，PM2.5可以導致H9C2心肌細胞線粒體損傷，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生過多，ATP合成減少，線粒體膜電位損害。解偶聯蛋白（uncoupling proteins，UCPs）是線粒體內膜上能夠通過轉運H+降低線粒體膜電位蛋白家族，與細胞內的ATP及ROS有著密切的關系[8-9]。在5種同類物中，UCP2分布最廣泛，體內和體外的研究發現，UCP2可以通過降低膜電位，減少ROS產生進而保護神經細胞組織[10]。

然而，UCP2在PM2.5導致的心肌細胞損傷過程中作用如何？目前研究甚少。本課題擬通過RNA干擾技術，沉默H9C2心肌細胞的UCP2表達，檢測PM2.5毒染心肌細胞的ROS、ATP改變及心肌細胞損傷指標，初步探討UCP2在PM2.5導致的心肌細胞損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 RNA干擾片段

由上海吉凱基因公司合成2條RNA干擾片段和1條陰性對照RNA干擾片段，分別為siRNA1，siRNA2和ncRNA。siRNA1序列為：上游，5-GCA CUG UCG AAG CCU ACA A dTdT -3'；下游，5-UUG UAG GCU UCG ACA GUG C dTdT -3。siRNA2 序列為：上游，5- CCU CAU GAC AGA CGA CCU C dTdT -3；下游，5- GAG GUC GUC UGU CAU GAG G dTdT -3。ncRNA序列為：上游，5- UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT -3；下游，5- ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT -3。

1.2 siRNA轉染步驟

（1）轉染前1d，5×104H9C2細胞接種在24孔板上，0.5mL完全培養基，轉染前細胞匯合達到70% ～ 80%；（2）在50μL無血清培養基加入2μL的siRNA，柔和混勻；（3）混勻lipofectamine試劑，用50μL無血清培養基稀釋1μL的lipofectamine試劑，輕輕混勻，室溫放置5min；（4）將稀釋好的siRNA和lipofectamine試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20min，以便形成siRNA-ipofectamine復合物；（5）將100μL的siRNA-ipofectamine復合物加到含400μL完全培養基的細胞孔中，來回輕柔搖晃細胞培養板；（6）細胞在37℃，5%CO2培養箱中，培養24h，檢測轉染后UCP2的表達情況。用siRNA-CY3（廣州瑞博公司）轉染，通過熒光顯微鏡進行效率驗證，計算轉染效率。本實驗轉染效率達到80%左右，說明該轉染步驟是可行的。

1.3 預實驗篩選

UCP2基因有效的干擾片段：將H9C2細胞隨機分成5組，即control組，lipo組，siRNA1組，siRNA2組，ncRNA組，分別給予同體積培養基、lipofectamine、siRNA1、siRNA2和ncRNA刺激，轉染步驟同1.2；轉染后48h檢測UCP2轉錄水平表達，步驟同1.4。

1.4 RT-PCR檢測UCP2基因表達

用TRIzol法提取H9C2細胞的總RNA，然后逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行擴增。根據讀取的CT值對基因進行相對定量。RT-PCR反應體系為：forward/reverse引物各0.25?L，SYBP Green PCR master mix 5?L，cDNA模板4μL。PCR進行45個循環，條件為：95℃，5min，95℃，15s，60℃ 30s。UCP2引物為：5- GGG CAC CTG TGG TGC TAC CTG-3（sense），5-ATG AGC TTT GCC TCC GTC CGC-3（antisense）；看家基因18s-RNA引物為：5-CCA TCC AAT CGG TAG TAG C -3（sense），5-GTA ATG GCG GGT CAT AAG-3（antisense）。

1.5 Western Blot檢測UCP2蛋白表達

用2×SDS裂解細胞，12000g/min 離心5min，提取總蛋白，然后用BCA法迅速進行蛋白濃度定量。提取的總蛋白，加入2×SDS蛋白上樣緩沖液（按1∶1的比例），100℃煮沸5min，-20℃保存備用。配置10% SDS-PAGE分離膠，5%的濃縮膠，微量進樣器吸取30?g樣品緩慢加入樣品孔中，用100V進行濃縮膠電泳20min，140V在分離膠中電泳40min。然后轉膜、封閉，加入一抗（proteintech 公司，貨號：11081-1-AP） 4℃過夜，PBST洗膜，加入二抗37℃反應1h，用化學發光法（ECL）顯影。

1.6 PM2.5的采樣及其配制

選取湛江市區汽車流量大、污染較重的地區為采樣點。用PM2.5采樣儀采集PM2.5，超聲震蕩，洗脫顆粒物，冷凍真空干燥成干粉，-20℃保存備用。配制：稱取一定量PM2.5干粉，經紫外線照射后加入培養基溶液混勻，配制成終濃度為10，50，100μg/mL的溶液進行預實驗。根據預實驗結果，本實驗選用50μg/mL作為細胞毒染劑量。

1.7 H9C2細胞處理及分組

H9C2細胞株購自中國科學院典型培養物保存委員會細胞庫，用10%小牛血清培養液，在37℃培養箱靜置培養；1～3d更換一次培養液。PBS輕柔沖洗，適量0.25%胰酶溶液消化等常規操作，進行傳代及實驗。當細胞生長至70%左右密度時，將細胞隨機分成三組，分別為NC組，PM2.5組及PM2.5+siRNA組，每組3個樣本。三組細胞分別給予常規的培養基，50μg/mL的PM2.5培養基，含PM2.5（50μg/mL）與siRNA（80nmol/L）的培養基刺激。48h后檢測相關指標。

1.8 肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）、ROS、線粒體ATP酶活力檢測

（1）H9C2細胞受刺激后48h，收集細胞培養基上清液，按照試劑盒說明采用比色法進行檢測CK和LDH濃度。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（比色法），貨號A020-1；肌酸激酶（CK）測定試劑盒（比色法），貨號A032；試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

（2）按照活性氧檢測試劑盒進行操作，購自碧云天，貨號S0033。簡要步驟為：各組細胞經過處理后，按照試劑說明用1∶1000無血清培養液稀釋DCFH-DA。去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。37℃細胞培養箱內孵育20min，然后用無血清細胞培養液洗滌細胞3次。用熒光分光光度計檢測[12]，激發波長488nm和535nm。

（3）ATP酶可分解ATP生成ADP及無機磷，測定無機磷的量可判斷ATP酶活力的高低。按照試劑盒采用比色法檢測ATP酶活力（購自南京建成生物工程研究所，試劑盒貨號：A016-1）。

1.9 統計學處理

所有計量資料均以（）表示，并采用SPSS18.0統計軟件進行統計分析。方差齊時，采用單因素方差分析進行統計，兩組間比較采用LSD法分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 干擾片段的篩選

control組，lipo組，ncRNA組，siRNA1組和siRNA2組間UCP2基因mRNA相對含量有顯著差異（F=3244，P<0.05）；control組，lipo組和ncRNA組兩兩之間差異無統計學意義（0.983±0.07，0.975±0.06，0.976±0.06；P>0.05）；與control組相比，siRNA1組，siRNA2組UCP2基因mRNA相對含量均顯著下降（0.983±0.07 vs 0.556±0.11，0.369±0.12，P<0.05）；其中siRNA2組下降尤其明顯，故選擇siRNA2作為UCP2基因的干擾片段進行后續的實驗。

2.2 各組UCP2基因轉錄水平和蛋白水平的表達

NC組，PM2.5組及PM2.5+siRNA組間UCP2基因mRNA相對含量及UCP2蛋白條帶相對密度值均有顯著差異（F1=899，F2=1057；兩者P<0.05）；UCP2基因mRNA相對含量及UCP2蛋白條帶相對密度值在PM2.5組明顯升高，而在PM2.5+siRNA組明顯降低，與NC組相比較，兩差異均有統計學意義（兩者P<0.05）。

2.3 各組H9C2細胞CK及LDH水平

CK和LDH是反映心肌細胞損傷的重要指標。本實驗發現，CK和LDH水平在PM2.5+siRNA組最高，在PM2.5組其次，在NC組最低，兩指標在三組間的差異顯著，均有統計學意義（FCK=429，P<0.05；FLDH=106，P<0.05）。

2.4 各組H9C2細胞ROS和細胞內ATP的水平

細胞ROS水平和ATP活性是反映線粒體功能的重要參數。本實驗發現，PM2.5+siRNA組心肌細胞內ROS含量明顯高于PM2.5組，PM2.5組的ROS明顯高于NC組，三組兩兩之間差異均有統計學意義（FROS=86，P<0.05）；而NC組ATP活性高于PM2.5組，PM2.5組ATP活性高于PM2.5+siRNA組，三組兩兩之間差異均有統計學意義（FATP=31，P<0.05）。見表2。

3 討論

近年來，環境污染越來越受到重視。PM2.5作為大氣污染的重要物質，可作為載體吸附有毒重金屬、酸性氧化物、有機污染物、細菌和病毒等多種組分，嚴重危害人體健康。多項流行病學調查研究顯示PM2.5不但可增加高血壓、冠心病、糖尿病患者的心血管疾病發病率和死亡率，亦可增高健康人群心血管疾病發病率和死亡率[11-12]。PM2.5可誘發、加重人體的心血管病變，這一認識被越來越多的學者所認同。本實驗通過培養大鼠心肌細胞株，給予PM2.5刺激，發現CK和LDH明顯升高，提示PM2.5可以導致心肌細胞損傷。這與國內外學者發現的PM2.5對心血管系統的毒性作用相一致[13-15]。

線粒體是重要的細胞器，是細胞生物氧化和能量合成的重要部位，細胞能量的80%來源于線粒體的呼吸功能。此外，線粒體也是ROS產生的重要部位。正常的線粒體功能，是維持細胞內充足ATP合成和低濃度的ROS的必備條件。線粒體的功能障礙，常常導致線粒體產生過多的ROS和ATP的生成不足或過多消耗，導致細胞或機體的過氧化損傷和能量缺乏。解偶聯蛋白（UCPs）是線粒體上的質子轉運蛋白，屬于線粒體陰離子通道家族。UCPs基因有高度的保守性，有6個家族成員，在人僅表達UCP1-5。UCP2基因位于11號染色體，與UCP3緊密連鎖，相隔僅6000bp。UCP2蛋白廣泛表達于各種組織細胞，現在多數認為其是保護性因素[16-18]。在神經系統中的保護方面，UCP2可以通過解偶聯作用，將H+轉運入線粒體，降低膜電位，減少ROS產生，維持細胞內的ATP水平，達到保護細胞的作用[19-20]。

我們前期的實驗發現，PM2.5可以通過損害心肌細胞的線粒體，破壞線粒體膜電位和線粒體的超微結果，導致線粒體ROS產生過多，ATP合成減少，進而損害細胞。然而，UCP2是否在PM2.5損害心肌細胞的線粒體的過程中起著保護作用，目前研究很少。RNA干擾是研究基因的流行技術。本實驗通過設計UCP2基因的干擾片段，進行預實驗，篩選出siRNA2作為干擾序列進行進一步研究。siRNA2導致了UCP2基因在轉錄和蛋白均出現低水平的表達，為探討UCP2的在PM2.5毒性過程的作用提供了基礎。

本實驗發現，通過RNA干擾沉默UCP2的表達，會導致細胞內ROS產生增多和細胞內ATP含量的減少，后者更進一步導致細胞的損害，表現為CK和LDH的明顯升高。PM2.5導致的UCP2過表達可能是細胞的代償反應，抑制UCP2表達將促進細胞的進一步損害。這就間接地表明，UCP2可能是PM2.5導致心肌細胞損害過程中的保護因素。然而，本實驗也存在明顯不足：（1）僅僅采用了沉默基因方法，沒有嘗試過表達UCP2，再觀察UCP2的作用；（2）指標檢測方面沒有將線粒體膜電位及線粒體腫脹度，線粒體生物修復功能等方面加以研究UCP2的作用。

綜上所述，PM2.5可以導致心肌細胞損傷，代償性引起UCP2表達增加；RAN干擾UCP2表達后，會導致細胞內ROS過度增多及ATP活性下降，從而加重細胞的損害；這一結果間接地表明，UCP2基因在PM2.5導致的心肌細胞損傷過程中可能起著保護作用。

[參考文獻]

[1] Wichmann HE. Daily mortality and fine and ultrafine particles in Erfurt， Germany part I： role of particle number and particle mass[J]. Res Rep Health Eff Inst， 2000（98）： 87-94.

[2] Vallejo M. Ambient fine particles modify heart rate variability in young healthy adults[J]. J Expo Sci Environ Epidemiol， 2006， 16（2）： 125-130.

[3] 鄭燦軍， 王菲菲，郭新彪. 大氣PM_（2.5）對原代培養大鼠心肌細胞的毒性[J]. 環境與健康雜志， 2006（1）： 17-20.

[4] Urch B. Acute blood pressure responses in healthy adults during controlled air pollution exposures[J]. Environ Health Perspect， 2005，113（8）：1052-1055.

[5] 董晨， 宋偉民，施燁聞.PM_（2.5）顆粒物引起血管內皮細胞氧化損傷的研究[J]. 衛生研究， 2005（2）：169-171.

[6] Mills NL.Ischemic and thrombotic effects of dilute diesel-exhaust inhalation in men with coronary heart disease[J]. N Engl J Med， 2007，357（11）： 1075-1082.

[7] Berger A. Runs of ventricular and supraventricular tachycardia triggered by air pollution in patients with coronary heart disease[J]. J Occup Environ Med， 2006，48（11）： 1149-1158.

[8] Mailloux RJ，Harper ME.Uncoupling proteins and the control of mitochondrial reactive oxygen species production[J]. Free Radic Biol Med，2011，51（6）：1106-1115.

[9] Basu Ball W.Uncoupling protein 2 negatively regulates mitochondrial reactive oxygen species generation and induces phosphatase-mediated anti-inflammatory response in experimental visceral leishmaniasis[J]. J Immunol， 2011，187（3）： 1322-1332.

[10] Conti B. Uncoupling protein 2 protects dopaminergic neurons from acute 1，2，3，6-methyl-phenyl-tetrahydropyridine toxicity[J]. J Neurochem， 2005，93（2）：493-501.

[11] Schneider A. Changes in deceleration capacity of heart rate and heart rate variability induced by ambient air pollution in individuals with coronary artery disease[J]. Part Fibre Toxicol， 2010，7： 29.

[12] Lipsett MJ. Long-term exposure to air pollution and cardiorespiratory disease in the California teachers study cohort[J]. Am J Respir Crit Care Med， 2011，184（7）： 828-835.

[13] Liu Y. Inhalation of diesel exhaust does not exacerbate cardiac hypertrophy or heart failure in two mouse models of cardiac hypertrophy[J]. Part Fibre Toxicol， 2013，10： 49.

[14] Wagner JG. PM2.5-induced cardiovascular dysregulation in rats is associated with elemental carbon and temperature-resolved carbon subfractions[J]. Part Fibre Toxicol， 2014，11： 25.

[15] 段軍.可吸入顆粒物對大鼠心臟交感神經分布和神經生長因子表達的影響及β受體阻滯劑的干預作用[D].北京：北京協和醫學院，2012：20-22.

[16] Azzu V. The regulation and turnover of mitochondrial uncoupling proteins[J]. Biochim Biophys Acta， 2010，1797（6-7）： 785-791.

[17] Baffy G. Uncoupling protein-2 and cancer[J]. Mitochondrion， 2010，10（3）： 243-252.

[18] Brand MD. Mitochondrial uncoupling protein 2 in pancreatic beta-cells[J]. Diabetes Obes Metab， 2010，12 （Suppl 2）： 134-140.

[19] Diano S. Uncoupling protein 2 prevents neuronal death including that occurring during seizures： a mechanism for preconditioning[J]. Endocrinology， 2003，144（11）： 5014-5021.

[20] Mattiasson G. Uncoupling protein-2 prevents neuronal death and diminishes brain dysfunction after stroke and brain trauma[J]. Nat Med， 2003，9（8）： 1062-1068.

（收稿日期：2014-10-17）