抗Ⅳ型膠原熒光抗體的制備及性質研究

吳鵬等

[摘要] 目的 采用異硫氰酸熒光素標識Ⅳ型膠原單克隆抗體，為直接或間接熒光方法檢測人體肝臟或血液中Ⅳ型膠原含量奠定基礎。 方法 采用直接透析方法進行熒光素標識，標識后通過Sephadex G25凝膠過濾，除去多余的熒光素和其他雜質，獲得標識熒光抗體純品。經SDS-PAGE和雙向免疫擴散凝膠電泳，對標識抗體進行純度，熒光特性，抗體特異性進行檢測鑒定。 結果 經全自動化學發光熒光圖像分析儀檢測SDS-PAGE電泳結果，激發波490nm，發射波510nm，在150KD處有一條黃綠熒光帶，其他處未見條帶出現，凝膠圖像分析儀檢測純度達96%；免疫瓊脂雙向擴散電泳結果顯示，標識抗體與未標識抗體與抗原之間均有乳白色沉淀線，且沉淀物含量一致，熒光分析儀檢測標識抗體與中心孔之間有黃綠色熒光條帶。 結論 采用本研究方法制備的熒光抗體具有純度高、熒光性好、特異性強等特點，為臨床檢測人體Ⅳ型膠原含量提供便利。

[關鍵詞] Ⅳ型膠原；熒光抗體；熒光素；FITC

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）01-37-03

[Abstract] Objective To lay the foundation of detecting the content of Ⅳ type collagen in human liver or blood through direct or indirect fluorescent method， Identifying monoclonal antibody of collagen typeⅣ by using the fluorescein isothiocyanate. Methods Using a direct dialysis method to identification of fluorescein. The purity of the identifying fluorescent antibody were obtained by Sephadex G-25 gel filtration column， which remove excess fluorescein and other impurities. The purity， fluorescence characteristic and specificity of antibody were measured with SDS-PAGE and double immune diffusion gel electrophoresis. Results The results of SDS-PAGE electrophoresis were measured by fully automatic chemiluminescence fluorescence image analyzer. Eexcitation wave 490nm and emission wave 510nm. The purified of antibody were shown only one strap of yellow with green fluorescence and the molecular weight （MW） of them were estimated to be approximately 150kD， its purity was 96%， there were not any other strap. The result of double agar gel immune-diffusion test showed that both identify antibodies and not identify antibody were combination with antigen， all of product were formed milky white precipitation lines of antigen-antibody complexes with antigen. And the sediment content was consistent. There was a strap of yellow with green fluorescence in the center hole by fluoroanalyzer. Conclusion In this study， the fluorescent antibody against human collagen type Ⅳ with high purity and strong specificity was produced by separation and purification methods， which provide convenience for clinical detection of the human body Ⅳ type collagen.

[Key words] Collagen type Ⅳ； Fluorescent antibody； Fluorescein isothiocyanate； FITC

免疫熒光技術是免疫檢測技術中的一種。這種技術是將熒光示蹤物質與抗體結合，利用抗原抗體反應的特異性，進行組織、細胞或體液內抗原物質的檢測[1]。免疫熒光技術現已廣泛應用于生物醫學的檢測中[2]。Ⅳ型膠原（ColⅣ）主要存在于各器官的基底膜中，是基底膜的微量成分，很多具有增生性質的疾病，ColⅣ含量與病變程度呈正相關；特

別是在肝纖維化的診斷和分型方面，ColⅣ在體內和組織中含量的檢測更為重要[3-4]。本研究采用異硫氰酸熒光素（FITC）標識Ⅳ型膠原單克隆抗體，同時對標識后抗體的熒光性及特異性進行鑒定分析[5]，為建立直接熒光和間接熒光檢測方法奠定基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

X100冷凍高速離心機（HITACHI）、LP型低壓層析系統（BIO-RAD）、2000C微量紫外可見光檢測儀（Thermoscientific）、F-4600熒光分光光度計（Hitachi）、2500+藍光凝膠分析儀（上海天能）、5500multi+RGB全自動化學發光熒光圖像分析儀（上海天能公司）。

1.2 主要試劑

Ⅳ型膠原抗體（本實驗室制備）、Sephadex G25凝膠填料（GE）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）（Sigma公司）、其他試劑均為國產試劑。

1.3 FITC標記Ⅳ型膠原抗體的制備和純化

采用透析法標記、凝膠過濾法純化[6-7]。取抗體溶液10mL，抗體含量為9mg，充分溶解。15000g/min，4℃，離心20min。棄上清，沉淀溶解于4mL pH9.8 NaHCO3緩沖液中，吹打混勻，溶液置透析袋中對上述緩沖液，4℃，透析6h，期間3次更換透析外液，透析過程在輕柔攪拌中進行。透析結束，透析內液5000g/min，4℃離心20min。取上清，微量紫外分光光度計檢測抗體含量為1.62mg/mL。上清裝入透析袋，置熒光標識液（200mL pH 9.8NaHCO3緩沖液+FITC 20mg至終濃度為0.1mg/L），避光4℃透析過夜。置透析袋于PBS中，終止反應透析10h，期間數次更換PBS至檢測480nm吸光值為零。取葡聚糖凝膠（SephadexG-25）10g，溶于去離子水中12h后裝柱。柱長1.5×30cm，200mL PBS平衡柱，將標識抗體溶液應用于SephadexG-25層析柱，流速0.2mL/min，餾分體積5mL/tube，紫外280nm監測，收集第一峰，體積為15mL；抗體濃度為0.51mg/mL。分裝后-80℃保存備用。

1.4 熒光抗體的鑒定

1.4.1 標識抗體的熒光特性及純度測定 采用SDS-PAGE電泳及凝膠分析儀、凝膠熒光分析儀鑒定標識抗體的熒光特性[8]。SDS-PAGE非還原性凝膠電泳（樣品緩沖液中不添加β-巰基乙醇），分離膠10%，濃縮膠3%，恒壓200V電泳2h。剝離膠板，蒸餾水浸洗2min，RGB多色熒光分析儀檢測。熒光檢測結束后，膠板用R-250考馬斯亮藍（0.25%）染色后，凝膠成像儀觀察。

1.4.2 標識的熒光抗體特異性測定 采用凝膠免疫雙向電泳檢測法[9]。0.9%鹽水瓊脂糖制備瓊脂板；待瓊脂凝固后，打孔器打孔，孔徑3mm，孔距10mm；加樣，1孔加純化后熒光抗體溶液（0.3mg/mL）、2孔加入未標識抗體溶液（0.3mg/mL）、3孔加入生理鹽水對照、中心孔加入Ⅳ型膠原（0.5mg/mL）；每孔加樣品20μL；瓊脂板玻片置37℃溫箱中12h。

2 結果

2.1 熒光抗體熒光特性和純度

5500multi+RGB全自動化學發光熒光圖像分析儀檢測電泳結果，激發波490nm，發射波510nm，標識抗體在150KD有一條黃綠色熒光帶，其他的位置未見條帶出現；凝膠經染色后，凝膠成像儀檢測可見標識、未標識抗體在150KD處均有一條帶，其他處有染色較淺的散在條帶（圖1）。凝膠分析儀分析標識抗體純度為96%。

3 討論

免疫熒光技術是利用熒光素對抗體（抗原）進行標記，之后用于免疫檢測。近年來，免疫熒光技術迅速發展，以其靈敏度高，準確性強等特點，廣泛應用于生物醫學和臨床診斷[10]?？贵w的熒光標識效果決定了熒光檢測結果的準確性，決定標識效果的因素除了熒光素偶聯的程度，更重要的是標識抗體的純度[11]。本研究采用透析標識法連接熒光素和抗體。采用Sephadex G25柱層析去除未標記的熒光素和雜質，經反復試驗確定其層析流速為0.2mL/min。SDS-PAGE電泳結果顯示標記抗體純度達到96%。經RGB多色熒光分析儀分析結果，標識后的抗體，在激發熒光490nm，發射波510nm處可見黃綠色熒光，符合FITC熒光素的熒光特性[12]。采用免疫雙向凝膠電泳方法檢測標識熒光抗體的特異性，結果顯示1孔和2孔與中心孔之間均有沉淀線形成，且線的粗細程度基本相同。經熒光分析儀檢測，可見1孔與中心孔之間有黃綠色線狀熒光。

綜上所述，本方法在常規透析標識后經Sephadex G25凝膠過濾層析后，可有效去除未連接的熒光素和其他雜質，進而保證了標識后抗體的純度。標識后抗體的特異性從雙向擴散免疫電泳結果分析，基本沒有損失。實驗結果證明經本方法可獲得純度高，特異性強的Ⅳ型膠原熒光抗體。為臨床采用直接和間接熒光法檢測人體Ⅳ型膠原，提供了方便條件，為臨床早期診斷肝纖維化奠定了基礎。

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（收稿日期：2014-10-21）