福建沿海臭鼩鼱感染巴爾通體調查研究*

臭鼩鼱(Suncusmurinus)屬食蟲目,鼩鼱科,常居于室內外陰濕處,近年來福建沿海地區臭鼩鼱密度有上升趨勢,且局部地區已在鼠形動物中形成優勢種群〔1〕。為了解福建沿海鼠形動物優勢種群臭鼩鼱感染巴爾通體情況及分布,掌握臭鼩鼱作為保存宿主感染的巴爾通體種屬,2006～2008年,我們開展了福建沿海6市臭鼩鼱中巴爾通體流行狀況的調查并作基因特征分析,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 調查點選擇 以福建省行政區劃為依據在沿海寧德、福州、莆田、泉州、廈門、漳州6地級市中各隨機抽取1個市(區)作為調查點,他們分別是蕉城區、福清市、荔城區、南安市、海滄區和龍海市。各調查點內選擇不同地理景觀和不同生境作為鼠籠布放點。

1.2 樣本采集保存 各調查點于每年4～9月采用籠d法捕鼠,無菌狀態經鼠股動脈采樣,液氮保存。1.3 培養與分離 分離方法參照美國報道方法〔2〕,并經本實驗室改良而來〔3〕,簡述如下：取血樣在1∶4BHI中稀釋液涂布于5%兔血瓊脂平板中,在5%CO2培養箱中36℃、RH85%中培養1～6W 后,可見圓形凸起,經BASO劉氏染色后,在油鏡下,可見極其微小桿菌或球桿菌,作為疑似菌待作下一步實驗。

1.4 PCR擴增對可疑巴爾通體菌株,使用煮沸法提取染色體DNA,制成模板后,-20℃保存備用。聚合酶鏈式反應(PCR)采用的引物是具有巴爾通體屬水平特異性的引物(BhCS781.p-BhCS1l37.n),擴增枸櫞酸合酶基因(gltA)的379bp片段以證實是否巴爾通體。上游引物BhCS781.p堿基序列為：5'-GGG GAC CAG CTC ATG GTG G-3',下游引物BhCS1l37.n堿基序列為：5'-AAT GCA AAA AGA ACA GTA AAC A-3'。PCR反應體系總量為μ l,含以下成分：北京天為時代科技有限公司的Pfu MasterMixp 17μ l,正向、反向引物各 1μ l,模板1μ l。擴增程序為95℃2min,48℃30s,72℃30s,再按94℃30s,48℃30s,72℃30s行30個循環,72℃延伸5min結束。取 6μ l PCR擴增產物于1.5%的瓊脂糠凝膠經80～100V 40min電泳,設標準分子量(Marker,50bp Ladde),陰性對照(用去離子水代替模板)。

1.5 序列分析 本研究設計引物TILE.455P-TALA.885.n擴增產物為核苷酸序列由上海生物工程技術服務公司測定。網上利用核苷酸序列對比程序BLAST2.0,與Genbank中注冊的核苷酸序列進行同源性比較。用DNASTA軟件進行雙序列同源性比對。用 Neighbor-Jouning tree(NJ)法建樹,采用Bootstrap驗證(n=1000)。

2 結 果

2.1 臭鼩鼱在鼠形動物中構成 本次調查共捕獲鼠形動物1161只,其中臭鼩鼱 294只,占 25.33%,與褐家鼠、黃胸鼠構成福建沿海地區鼠形動物優勢種群,見表1。

2.2 巴爾通體分離 2006～2008年,共從6個采樣點捕獲臭鼩鼱294只,從中分離出疑似菌株,經PCR證實,有63株為巴爾通體。巴爾通體細菌學性狀、gltA擴增產物及電鏡形態見圖1～3。

2.3 地區及鼠間分布 臭鼩鼱感染巴爾通體,感染率21.43%,分布在福建沿海各地市中,見表2。且臭鼩鼱感染率(21.43%)高于黃胸鼠(18.27%)、褐家鼠(13.54%)及其它鼠種(10.87%),χ2=10.781,P＜0.05。見表3。

表1 福建沿海6市鼠形動物構成(2005-2008年)Table 1 Constituent ratio of rodent from six investigated districts of Fujian coastal region(2005-2008)

圖4 福建省沿海巴爾通體系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bartonella species from Fujian coastal region

2.4 基因特征與地域/宿主的關系

2.4 基因特征與地域/宿主的關系 在沿海6市(區)63株臭鼩鼱巴爾通體菌株中隨機抽取19株作gltA基因的379bp片段序列測定。序列分析表明,巴爾通體感染臭鼩鼱明顯的種群分布特征和地域分布特征。福建省共從鼠形動物中檢出：B.elizabethae、B.qeenslandensis和B.tribocoram三種巴爾通體,而臭鼩鼱僅攜帶B.tribocoram種,且廈門海滄16株均感染B.tribocoramB亞群,福清1株感染B.tribocoramB亞群,而南安2株均感染B.tribocoramA亞群(圖 4)。

3 討 論

臭鼩鼱是南亞熱帶氣候區的主要鼠形動物之一,且隨著氣溫的提高,福建省近十年來臭鼩鼱的數量有明顯上升趨勢,每年的3～4、9～10月份占有絕對優勢〔1〕。本調查雖未連續觀測臭鼩鼱的月動態變化,但其占室內鼠形動物的25.33%,比重不小。因此,研究臭鼩鼱感染巴爾通體的流行狀況很有必要。

本文首次描述了臭鼩鼱感染巴爾通體的流行與分布特征,證實它是巴爾通體的保存宿主,從而填補了巴爾通體在食蟲目鼩鼱科動物中流行狀況的空白。從249份臭鼩鼱血樣中共分離到63株巴爾通體,分離率達21.43%,菌株在福建沿海各市(區)臭鼩鼱均有分布,表明巴爾通體在臭鼩鼱廣泛存在,重度流行,預防控制巴爾通體應將臭鼩鼱列入重點對象。

系統發育發析表明閩東南沿海臭鼩鼱巴爾通體僅為B.tribocoram種A、B兩個亞群,該型巴爾通體為Heller等〔4〕首先從法國褐家鼠分離得到,且地域分布特征明顯。本研究再次證實了此觀點,海滄、福清17株均為Tirtocorum.B,而南安2株均為B.tribocoramA。有鑒于此,對于臭鼩鼱感染巴爾通體種型與地理景觀及其生存環境的關聯還有待進一步調查研究。

(感謝蕉城區、福清市、荔城區、南安市、龍海市疾病預防控制中心同仁參加樣本采集。)

表2 福建沿海6市臭鼩鼱中巴爾通體感染的感染率Table 2 Infection rate of Bartonella in Suncus murinus from six investigated districts of Fujian coastal region(%)

表3 福建沿海6市鼠形動物巴爾通體感染率(2005-2008年)Table 3 Infection rate of Bartonella in rodent from six investigated districts of Fujian coastal region(%)(2005-2008)

〔1〕周淑恒,陳亮,李述楊,等.福建臭鼩鼱種群數量分布調查〔J〕.海峽預防醫學雜志,2003,9(5)：37-38.

〔2〕Kosoy M,regnery R,T sianbosT,et al.Distribution,diversity and host specity ofBartonallain rodents from the southeastern United States〔J〕.Am J Trop Med Hyg,1997,57 ：578-588.

〔3〕葉曦,姚美琳,李國偉.福建省鼠形動物巴爾通體感染調查〔J〕.中國人獸共患病學報,2006,22(8)：779-781.

〔4〕Heller R,Rieg ler P,Hansmann Y,et al.Bartonella tribocoramsp.nov,a newBartonellaspecies is olated from the blood of wild rats〔J〕.International Journal of Systematic Bacteriology,1998,48：1333-1339.