隱孢子蟲對宿主細胞凋亡的調控機制研究進展

逯兆喜,吳 亮,陳盛霞,曹建平

隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)是一種在世界范圍內廣泛流行的人獸共患寄生蟲。隱孢子蟲感染人類后,主要寄生于消化道上皮細胞,引起隱孢子蟲病(cryptosporidiosis),癥狀包括腹痛、腹瀉和消瘦等,是WHO認定的6種常見感染性腹瀉的病因之一。免疫功能正?；颊?腹瀉通常呈自限性,2～3w可自行消失;但免疫功能低下(嬰幼兒)和免疫功能缺陷(AIDS等)患者的腹瀉則會導致嚴重后果,甚至可致死亡〔1〕。細胞凋亡作為清除胞內病原體的一種有效措施,在宿主對抗病原體感染中具有重要作用。同時,許多胞內寄生蟲,如弓形蟲、瘧原蟲、利什曼原蟲、隱孢子蟲等可采用多種手段調控宿主細胞凋亡從而有利于其寄生生活〔2〕。本文對隱孢子蟲調控宿主細胞凋亡的機制進行綜述。

1 隱孢子蟲調控宿主細胞凋亡及意義

凋亡是細胞死亡的內在機制,受多種信號通路調節,在清除受損細胞、維持內環境穩定及促進機體成熟過程中起重要作用。此外,凋亡作為一種重要的防御機制,可對抗病毒、細菌及寄生蟲感染。

Chen等首次報道微小隱孢子蟲(C.parvum)感染可致膽管上皮細胞凋亡〔3〕。Ojcius等報道微小隱孢子蟲感染HCT-8(human ileocecal adenocarcinoma cell line,人回盲腸腺癌細胞系)細胞后,可致細胞凋亡,且凋亡率隨蟲體感染量的增加而增加〔4〕。Widmer等研究表明微小隱孢子蟲感染可致MDBK(Madin Darby bovine kidney,牛腎細胞)及 HCT-8細胞凋亡,并降低細胞貼壁能力。當培養液中加入Caspase(半胱氨酸蛋白酶)抑制劑后,細胞脫落量顯著減少,但未增加細胞中蟲體數量;而用層粘連蛋白包被的培養板時,可減少細胞脫落量并增加細胞感染率。這說明感染早期細胞脫落及凋亡不利于隱孢子蟲存活〔5〕。McCole等研究發現微小隱孢子蟲感染Caco-2(colonic adenocarcinoma cell line,結腸腺癌細胞系)和HCT-8細胞后,可致細胞中度凋亡,但可抑制星狀孢子素、依托泊苷和5-氟尿嘧啶等凋亡誘導劑所致的細胞凋亡〔6〕。Liu等研究表明微小隱孢子蟲感染早期(6 h和12 h)抗凋亡基因上調,促凋亡基因下調;感染晚期(24、48和72 h)促凋亡基因上調,抗凋亡基因下調〔7〕。此外,Sasahara等研究發現微小隱孢子蟲可致小鼠回腸上皮細胞凋亡〔8〕。

由此可見,隱孢子蟲可通過調控宿主細胞凋亡,以促進自身發育和增殖。此外,微小隱孢子蟲感染所致細胞凋亡可能與愛滋病患者硬化性膽管炎的發病機制有關〔3〕;并可能破壞細胞間緊密連接及細胞屏障功能,增加腸粘膜通透性,致患者嚴重腹瀉,甚至死亡〔9-10〕。

2 隱孢子蟲感染宿主細胞凋亡的調控機制

目前已知的參與隱孢子蟲調控宿主細胞凋亡相關的因子主要包括Fas/FasL 、Caspases、核因子-κ B(nuclear factor-kappa B,NF-κ B)以及 Tat(transactivator of transcription,Tat,反式轉錄激活因子)蛋白、生存素、骨保護素和表皮生長因子等其他凋亡相關因子。

2.1 Fas/FasL在隱孢子蟲調控宿主細胞凋亡中的作用 死亡受體Fas(又稱APO-1/CD 95) 屬于腫瘤壞死因子α受體家族成員,FasL(Fas ligand)為Fas的配體。Fas/FasL是目前研究得較清楚的外源性凋亡途徑。Fas具有3個富含半胱氨酸的胞外區和1個稱為死亡結構域(Death domain,DD)的胞內區。FasL與 Fas結合后,Fas三聚化使胞內的DD區構象改變,與接頭蛋白FADD(Fas-associated death domain,Fas相關死亡結構域)的DD區結合;而后FADD的N端DED(death effector domain,死亡效應結構域)區與Caspase 8(或10)前體蛋白結合,形成 DISC(death-inducing signaling complex,死亡誘導信號復合物)。富集在一起的Caspase 8前體可在其大小亞基之間進行切割,產生有活性的Caspase 8,啟動 Caspase級聯反應,使 Caspase 3、6、7激活。這3種Caspase可降解胞內結構蛋白和功能蛋白,最終導致細胞凋亡〔11〕。已有研究表明Fas/FasL在原蟲(如剛地弓形蟲、克氏錐蟲等)調節宿主細胞凋亡中發揮重要作用。

Chen等報道微小隱孢子蟲感染H69細胞24 h,經 DAPI(4＇,6-diamidino-2-phenylindole,4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色可見凋亡細胞,且細胞凋亡率明顯高于對照組。在感染后的24 h內,細胞凋亡率隨蟲體感染量及感染時間的增加而增加。若在微小隱孢子蟲感染前30 min將培養基換為含Fas/FasL抗體或Caspase抑制劑的培養基,蟲體感染24 h和48 h后細胞凋亡率顯著減少,Caspase抑制劑對細胞凋亡的抑制率達80%。這表明Fas/FasL途徑是微小隱孢子蟲致細胞凋亡的主要機制。進而經Western blotting證實微小隱孢子蟲感染6 h,FasL表達量降低;而感染12 h和24 h FasL表達量顯著增加;Fas表達量僅在感染24 h顯著增加。研究還發現當微小隱孢子蟲感染的H69細胞與未感染的Fas敏感的Jurkat E6-1細胞共培養24 h后,Jurkat E6-1細胞凋亡率顯著增加,而FasL抗體可完全抑制此細胞的凋亡;當Fas抗性的Jurkat JM-3A5細胞與隱孢子蟲感染的 H69細胞共培養時,Jurkat JM-3A5細胞凋亡率未見增加。此外,免疫細胞化學技術及激光共聚焦顯微鏡檢測結果表明,微小隱孢子蟲可增加FasL的膜遷移,并誘導細胞膜表面FasL裂解為sFasL(soluble FasL,可溶性FasL),進而導致Jurkat E6-1細胞凋亡。由此推測微小隱孢子蟲通過自分泌和旁分泌途徑,以Fas/FasL依賴機制誘導膽管上皮細胞凋亡(圖1〔12〕)。

圖1 微小隱孢子蟲誘導膽道上皮細胞凋亡模型Fig.1 Schematic model of C.parvum-induced apoptosis in biliary epithelial cells

Motta等報道微小隱孢子蟲感染HCT-8細胞24 h后,感染蟲體的細胞膜表面FasL表達量顯著增加;而未感染蟲體的細胞,其膜表面FasL表達量未見改變。此外,小鼠模型實驗顯示微小隱孢子蟲感染第16d,小腸上皮細胞FasL表達量顯著增加。當以微小隱孢子蟲感染野生型及lpr(lymphoproliferative disorder,淋巴增生性障礙)小鼠時,感染第14d CD4+細胞缺陷的野生型小鼠體重減輕,而后隨著感染時間延長體重增加,但增加速度低于對照組;而lpr及CD4+細胞缺陷lpr小鼠感染后體重增加,兩者之間無顯著性差異。這表明Fas蛋白表達可影響CD4+細胞缺陷的野生型小鼠的體重,故推測Fas依賴的未感染細胞的凋亡加劇隱孢子蟲病所致的體重減輕〔13〕。

Mele等以抗體標記實驗,經流式細胞儀分選微小隱孢子蟲感染及未感染細胞,結果顯示FasL僅在感染后2 h和24 h的感染細胞中表達,而Fas在感染及未感染細胞中表達量無顯著差異。由此可見,微小隱孢子蟲通過Fas受體下游效應酶調控細胞凋亡〔14〕。

2.2 Caspase級聯反應在隱孢子蟲調控宿主細胞凋亡中的作用 Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶,是細胞凋亡反應的重要組成部分。Caspase參與的細胞凋亡反應一般分為兩類。一類是Caspase啟動酶 ,包括 Caspase 2 、8、9 、10,位于 Caspase 級聯活化途徑上游,可通過蛋白質與蛋白質相互作用自我激活。另一類是 Caspase效應酶,包括 Caspase 3、6、7,位于整個凋亡信號的下游,多種來自上游的信號最終都匯集于此。此酶可被Caspase啟動酶激活,進而降解胞內蛋白,使細胞不可逆地走向死亡〔15〕。

Ojcius等以 DAPI、流式細胞術及 DNA ladder實驗證實微小隱孢子蟲感染HCT-8后,細胞發生凋亡。在微小隱孢子蟲(卵囊/細胞為1∶1)感染前30 min加入Caspase抑制劑Z-VAD-FMK后,可抑制細胞凋亡,增加細胞感染率。這表明Caspase參與微小隱孢子蟲感染所致的細胞凋亡〔4〕。Mele等研究顯示微小隱孢子蟲感染 HCT-8細胞后,Caspase 3活性在2 h顯著增加,24 h減少,48 h再次增加,54 h達高峰。經流式細胞儀分選感染及未感染細胞后,測得Caspase 3活性在2 h時感染細胞中較高,未感染細胞較低;而在24 h時則相反。這說明在微小隱孢子蟲感染后的不同時間,Caspase 3活性不同,因而細胞凋亡率也存在差異。同時,通過免疫組化證實感染后6h、24 h、48 h和 72 h,微小隱孢子蟲的發育階段分別為卵囊和子孢子、滋養體和裂殖體、裂殖體和裂殖子、裂殖子和雄配子體期。由此推測隱孢子蟲在發育的不同時期,通過調節宿主細胞凋亡基因的表達,抑制或促進細胞凋亡,以維持自身生存〔14〕。

Liu等研究發現微小隱孢子蟲感染HCT-8細胞24 h后Caspase 4、3、6活性增加,48 h后其活性降低;加入Caspase抑制劑未影響細胞感染率,但可顯著降低細胞凋亡率;而降低蟲體感染量(卵囊/細胞為10∶1),Caspase抑制劑可顯著降低細胞感染率。以星狀孢子素處理未感染HCT-8細胞2 h,其細胞凋亡率為60%,Caspase 3/7活性增加7倍;而微小隱孢子蟲感染HCT-8細胞24 h,Caspase 3/7活性僅增加 2.5倍;然而當微小隱孢子蟲感染HCT-8細胞24 h后,再以星狀孢子素處理細胞2 h,Caspase 3/7活性未見增加。這表明微小隱孢子蟲可抑制星狀孢子素誘導Caspase 3/7的激活。由此推測微小隱孢子蟲可通過激活Caspase介導細胞凋亡,但也可抑制腸上皮細胞Caspase的激活。此外,研究還發現微小隱孢子蟲感染HCT-8細胞24 h和48 h,裂殖體和裂殖子數量無明顯改變,但滋養體數量增加;而當加入Caspase抑制劑后,子孢子數量顯著增加,裂殖體數量顯著減少,滋養體數量僅在感染的24 h顯著增加。由此推測激活Caspase是微小隱孢子蟲生長所必須的,在感染晚期,抑制細胞凋亡和/或抑制Caspase可阻礙微小隱孢子蟲的正常發育〔7,16〕。

2.3 NF-κ B在隱孢子蟲調控宿主細胞凋亡中的作用 NF-κ B是一種核蛋白因子,幾乎存在于所有細胞。靜息狀態下 ,NF-κ B 與 Iκ B(inhibitor of NF-κ B,NF-κ B抑制蛋白)以非活性形式存在于胞漿中;細胞受刺激后,IKK(Iκ B kinase,Iκ B 激酶)被激活,Iκ B經快速磷酸化、泛素化后降解,使NF-κ B游離于胞漿中,并迅速轉入到細胞核內,與特定基因的啟動子區域結合,啟動基因轉錄,調節細胞功能。Iκ Bα是NF-κ B最重要的調節因子,可抑制 NF-κ B的激活。當病原體(如小泰勒蟲)侵襲時,核轉錄因子的激活在胃腸上皮細胞免疫反應中發揮重要作用。在上皮細胞免疫或炎癥反應中,轉錄因子NF-κ B家族可激活多種基因,如 IFN-γ(interferon-γ,γ干擾素)、IL-8(interleukin-8,白細胞介素 8)等〔17〕。NF-κ B還可激活某些胞內生存信號,如原癌基因(c-Myc)、凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis,IAP)等,在抑制 TNF-α、Fas抗體、射線、化療藥物誘導的細胞凋亡中起重要作用〔18〕。

Chen等以免疫印跡、電泳凝膠阻滯及免疫熒光實驗證實,NF-κ B系統激活僅發生于微小隱孢子蟲感染的細胞,進而導致Iκ Bα蛋白降解。ELISA 結果顯示隱孢子蟲感染細胞后,可增加IL-8分泌且具有時間依賴性,而抑制劑MG-132及SN50可分別抑制 Iκ Bα蛋白降解 ,阻止 NF-κ B 與 DNA 結合 ,顯著降低IL-8分泌。DAPI染色結果表明微小隱孢子蟲感染24 h,細胞凋亡率增加,且MG-132或SN50可顯著增加微小隱孢子蟲所致H69細胞的凋亡。進一步經微小隱孢子蟲多克隆抗體及DAPI染色證實細胞凋亡僅發生于未感染細胞。由此推測微小隱孢子蟲感染直接激活NF-κ B/Iκ B途徑,抑制感染細胞凋亡,維持自身生存和繁殖;通過旁分泌途徑誘導未感染細胞凋亡,限制感染擴散(圖2〔18〕)。

圖2 微小隱孢子蟲誘導NF-κ B激活、IL-8分泌及膽管上皮細胞凋亡模型Fig.2 Schematic model of C.parvum-induced NF-κ B activation and its relevance to IL-8 secretion from,and associated epithelial apoptosis in biliary epithelial cells

2.4 其他凋亡相關因子在隱孢子蟲調控宿主細胞凋亡中的作用

2.4.1 Tat蛋白 Tat蛋白是HIV-1基因組編碼的一個重要調控蛋白,含 101個氨基酸殘基,是HIV轉錄和復制所必須,還有旁分泌、促細胞生長、免疫抑制及內化等多種效應〔19〕。Tat蛋白還可抑制沙門氏菌侵入H T-29細胞。此外,表達Tat蛋白的細胞對凋亡刺激更敏感,且協同 T細胞增加FasL表達,激活Fas死亡受體,導致細胞凋亡性死亡〔20〕。

O'Hara等證實 Tat蛋白可增加胞質中FasL表達,而不影響細胞凋亡率及FasL膜遷移,但當微小隱孢子蟲感染細胞后,FasL及細胞凋亡率隨Tat蛋白濃度的增加而增加,且細胞凋亡主要發生于未感染細胞。經微小隱孢子蟲與Tat蛋白共存實驗證實,Tat蛋白增加感染細胞中FasL膜遷移及釋放。FasL抗體NOK1或Caspase 8抑制劑Z-IETD-fmk可抑制Tat蛋白的作用,減少細胞凋亡率。這表明Tat蛋白以FasL途徑促進隱孢子蟲誘導的細胞凋亡〔21〕。

2.4.2 生存素 近年發現的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)是一種重要的抗凋亡因子。目前人類 IAP家族已發現 8個成員：c-IAP1、c-IAP2、NAIP、XIAP、Survivin、ML-IAP,Livin、Bruce(Apollon)和 ILP2。其中生存素(Survivin)是IAP家族中最小的成員,僅有一個半胱氨酸/組氨酸的桿狀病毒IAP的BIR功能區,此功能區可直接或間接作用于Caspase,抑制其活性,實現抗凋亡功能〔22〕。

Liu等研究發現凋亡抑制蛋白降低Caspase活性,且與微小隱孢子蟲感染抑制宿主細胞凋亡是同步的。通過siRNA技術敲除Survivin或XIAP可致感染24 h和48 h的Caspase 3/7活性顯著增加。然而僅敲除Survivin時,感染24 h和48 h細胞凋亡率顯著增加。這表明Survivin和 XIAP可抑制Caspase 3/7活性,但僅 Survivin抑制宿主細胞凋亡〔16〕。

2.4.3 骨保護素 骨保護素(osteoprotegerin,OPG)是一種分泌性糖蛋白,為目前已發現的T RAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand,腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體)受體(DR4,DR5,DcR1,DcR2和OPG)中的一種。其中DR4和DR5為死亡受體,可與T RAIL結合,導致相應受體三聚化,通過FADD與胞質中Caspase 8前體蛋白結合,激活 Caspase 系統,誘導細胞凋亡〔21〕;而 OPG,DcR1和DcR2為死亡誘騙受體(death decoy receptor),可競爭性與 TRAIL結合,但缺乏完整的死亡結構域,因此不能誘導細胞凋亡〔23〕。

Gonzalez等研究表明隱孢子蟲感染人腸上皮細胞后,OPG基因表達量顯著增加,且人隱孢子蟲(C.hominis)感染的細胞OPG表達量高于微小隱孢子蟲感染的細胞。研究還發現感染火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)的志愿者,空腸組織中OPG表達量顯著增加。微小隱孢子蟲感染HCT-8細胞1 h,OPG mRNA及上清中OPG蛋白表達量增加;感染3 h OPG mRNA表達量顯著增加;而感染12 h,OPG mRNA及上清中OPG蛋白表達量與對照組相比無顯著差異。這表明OPG mRNA及蛋白分泌增加始于感染早期,抑制細胞凋亡,有利于隱孢子蟲完成生活史。而T RAIL可顯著降低隱孢子蟲感染量,增加細胞凋亡率。由此表明OPG作為一種可溶性誘騙受體與T RAIL結合,抑制細胞凋亡〔24〕。

2.4.4 表皮生長因子 表皮生長因子(epidermal grow th factor,EGF)是由53個氨基酸組成的低分子量(6.4kD)多肽。多種組織如唾液腺、腎臟、小腸、肝臟及胰臟等可分泌EGF。EGF與特異性受體結合后發揮多種生物學效應,如促進細胞增殖、傷口愈合、胃腸功能成熟。曾有研究認為EGF可有效刺激腸道修復,且口服EGF抑制病原微生物在腸道的定居〔25〕。

Buret等經 Hoechst染色證實安氏隱孢子蟲(C.andersoni)感染人(SCBN和CacO2)和牛(MDBK和NBL-1)上皮細胞24 h,細胞凋亡率均顯著增加。當隱孢子蟲感染經 rhEGF(recombinant human EGF,重組人表皮生長因子)預處理的上皮細胞后,24 h細胞感染率顯著降低,凋亡率與對照組相比無顯著差異。此外,PI(propidium iodine,碘化丙啶)及免疫熒光實驗顯示EGF不影響安氏隱孢子蟲的活力。由此推測,EGF可降低安氏隱孢子蟲感染率并抑制其介導的細胞凋亡〔10〕。

3 結 語

隱孢子蟲作為一種專性胞內寄生蟲,在發育的不同時期抑制或促進細胞凋亡對其生存和繁殖具有重要意義。對隱孢子蟲調控宿主細胞凋亡的研究,有助于進一步了解宿主與隱孢子蟲之間的關系。然而細胞凋亡是一個復雜的過程,是多種抗凋亡和/或促凋亡因子共同作用的結果。因此,探討細胞凋亡發生的機制,選擇性的抑制或促進細胞凋亡的發生,將為隱孢子蟲病治療提供新途徑。

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