細粒棘球蚴感染中國美利奴羊免疫指標的動態變化*

杜迎春,白春生,賈 斌,沈曉莉,申 紅,蔣 松

2.新疆農一師五團畜牧獸醫工作站,阿克蘇 843015;

3.四川巨星集團公司成都市 610000

細粒棘球蚴病(Cystic Echinococcosis,C.E)又稱包蟲病,是由細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus,E.g)的幼蟲(續絳期)寄生在各種中間宿主(人和食草動物如牛、羊)的肝臟、肺臟等器官內發育為包囊引起的一種人畜共患病。綿羊是細粒棘球絳蟲最適宜的中間宿主,在中國西部牧區,綿羊包蟲病已經嚴重地影響了養羊業的發展和農牧民生活質量的提高。包蟲在宿主體內經過了長期適應過程,可從宿主體內攝取營養而生存,并且基本上與外界環境隔絕,具有擾亂或逃避宿主機體免疫反應的能力,因此包蟲病的免疫學研究仍然是目前的研究熱點之一。本試驗以中國美利奴羊(新疆軍墾型)為中間宿主,檢測宿主在人工感染細粒棘球絳蚴的不同時期感染羊和未感染羊免疫指標的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 2歲健康雌性中國美利奴羊(新疆軍墾型)14只,體重40-50kg,購自新疆生產建設兵團農九師165團。預飼期進行包蟲病ELISA血清學檢測,確保試驗綿羊沒有感染包蟲病,預飼7d后進行人工感染。

1.2 細粒棘球絳蟲 從感染細粒棘球蚴病的試驗犬體內分離。

1.3 主要試劑和儀器 綿羊包蟲病ELISA診斷試劑盒(深圳康百得公司)。綿羊抗體和IFN-γ檢測試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)。CD4單克隆抗體(MOUSE ANT I OVINE CD4：FITC),CD8單克隆抗體(MOUSE ANTI OVINECD8：RPE),CD45R單克隆抗體(MOUSE ANTIOVINE CD45R：FITC)均為Caltag Laboratories公司產品。溶血劑,購自德國Partec公司。流式細胞儀為德國Partec公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 包蟲病ELISA血清學檢測 按試劑盒說明操作,確保試驗羊均健康。

1.4.2 細粒棘球絳蟲分離 試驗前,試驗犬用吡奎酮和丙硫苯咪唑驅蟲(用量10mg/kg),然后注射地噻米松降低其免疫力,用患細粒棘球蚴病羊的肝臟飼喂試驗犬,連續飼喂7d,60d后檢測到糞便有細粒棘球絳蟲卵排出者為試驗犬感染了包蟲病。將感染包蟲病的試驗犬麻醉、宰殺,從犬的小腸前段(主要是十二指腸和空腸前段)絨毛內分離細粒棘球絳蟲,挑出帶有成熟孕節的蟲體(蟲體長3～8mm,一般由3個或4個體節組成,最多含有7個體節,頭部呈梨形,端部略窄,上具頂突和4個吸盤,頂突有兩排約28～50個小鉤,末端體節為孕卵節片。)顯微鏡下分離計數。

1.4.3 人工感染 用注射器將10個成蟲孕節直接注射到綿羊食管中,用生理鹽水反復注射2次,確保孕節不遺留在注射器內。

1.4.4 人工感染前7d(-7d)、感染當天(0d)、感染后7d、21d、30d、60d采集綿羊新鮮的抗凝血和全血,分離血清。試驗結束時宰殺綿羊進行病理剖檢。

1.4.5 淋巴細胞亞群的檢測 采用流式細胞儀檢測。

1.4.6 血清中 IgG、IgM、IgE、IFN-γ檢測 用ELISA試劑盒檢測。

1.4.7 血液中粒細胞計數用瑞氏染色法。

1.4.8 數據統計所有數據均用SPSS13.0統計學軟件單因素方差分析,試驗數據采用平均數±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 攻蟲結果 試驗羊人工感染細粒棘球絳蚴后第60d,宰殺進行病理剖檢。剖檢以肝臟表面有明顯細粒棘球蚴囊腫突起、鏡檢囊液有棘球砂者判定為人工攻蟲感染為陽性。結果,人工感染的14只綿羊中8只感染,6只未感染。

2.2 淋巴細胞亞群檢測結果 CD4+T細胞百分數在攻蟲后第7d、30d未感染組顯著高于感染組(P＜0.05)。未感染組的CD8+T細胞在攻蟲后第7d顯著高于攻蟲前第7d(P＜0.05);CD4+/CD8+比值和B淋巴細胞兩組之間差異不顯著(P＞0.05),見表1。

表1 外周血中CD4+T、CD8+T、B淋巴細胞和CD4+T/CD8+T比值變化Table 1 Changes of CD4+T,CD8+T,B lymphocyte and CD4+/CD8+ratio in the peripheral blood

2.3 血清中抗體檢測結果 IgG水平在攻蟲后第30d未感染組顯著高于感染組(P＜0.05),感染組IgG水平在攻蟲后第7d極顯著高于攻蟲0d(P＜0.01);感染組IgM 水平在攻蟲后第7d顯著高于攻蟲0d(P＜0.05);IgE水平在攻蟲后第30d未感染組顯著高于感染組(P＜0.05),感染組IgE水平在攻蟲后第 7d達到峰值,顯著高于攻蟲0d(P＜0.05),之后開始下降,攻蟲后第60d顯著低于攻蟲后第7d(P＜0.05);未感染組IgE水平在攻蟲后第30d達到峰值,顯著高于攻蟲當天(P＜0.05),下降緩于感染組,并維持在較高水平,攻蟲后第60d顯著低于攻蟲后第30d(P＜0.05);未感染組IFN-γ水平在攻蟲后第21d、30d顯著高于感染組(P＜0.05),見表2,3。

表2 血清中IgG和IgM變化Table 2 Changes of IgG and IgM in the blood serum

表3 血清中IgE和 IFN-γ變化Table 3 Changes of IgE and IFN-γin the blood serum

2.4 血液中粒細胞檢測結果 感染組與未感染組的白細胞水平無顯著差異,但是攻蟲0d與攻蟲前-7d比較有顯著的下降。末感染組在攻蟲后第21d顯著高于攻蟲0d(P＜0.05);淋巴細胞在攻蟲后第21d(P＜0.01)、30d(P＜0.05)未感染組顯著高于感染組;嗜中性粒細胞在攻蟲后21d感染組極顯著高于未感染組(P＜0.01),見表4。

表4 外周血中白細胞、淋巴細胞和嗜中性細胞細胞變化Table 4 Changes of Leukocyte,Lymphocyte and Neutrophil in the peripheral blood

3 討 論

在寄生蟲感染中,宿主的年齡、性別和生理學狀態都可能影響宿主先天的易感性或抵抗力〔1〕。此外,用細粒棘球絳蟲蟲卵或六鉤蚴感染小鼠的感染性試驗顯示易感性會隨不同品系的小鼠種類改變〔2〕。本研究中對在相同生理狀態下的14只同一品種的中國美利奴羊進行人工攻蟲,結果顯示8只感染,6只未感染。通過分析感染羊和未感染羊的T淋巴細胞亞群,發現未感染綿羊的CD4+T細胞水平在攻蟲后第7d、30d顯著高于感染羊(P＜0.05),這提示綿羊的CD4+T細胞在細粒棘球蚴感染過程中有一定的免疫保護作用,可以提高宿主對細粒棘球蚴的抵抗力。Gill等〔3〕發現,CD4+T細胞在美利奴羊的抗蠕蟲感染中也起重要作用。在寄生蟲感染的免疫應答中,誘導機體產生的保護性免疫主要與CD4+T細胞亞群及產生的細胞因子有關。CD4+T細胞除識別與MHCII類分子結合的外源性抗原外,還可誘導B淋巴細胞產生和分泌抗體,發揮體液免疫功能,對CD8+T細胞也有重要的輔助和調節作用,而且也通過自身分泌很多重要的細胞因子,直接參與細胞免疫反應,所以CD4+T細胞是主要誘導群,可以啟動和參與免疫應答,在免疫應答中處于核心地位〔4〕。CD8+T細胞識別與MHCI類分子結合的內源性抗原,而黏膜上皮細胞表達MHCI類抗原復合物,因此,黏膜上皮細胞可充當抗原遞呈細胞。CD8+T細胞常與蟲體感染上皮細胞直接接觸,感染的上皮細胞就成為細胞毒性T細胞的靶細胞,通過釋放穿孔素和淋巴毒素來溶解和破壞靶細胞而發揮殺傷效應。CD4+/CD8+的比值可以反映機體內的免疫過程,CD4+/CD8+比值上升機體呈保護性免疫,反之,則呈損傷性免疫。CD4+T細胞作為調節細胞,主要是啟動免疫應答和控制初次感染;CD8+T淋巴細胞作為一種效應細胞,是抵抗再感染的主力,二者分工不同,但又密不可分。

B淋巴細胞水平對體液免疫中抗體的產生很重要,體液免疫中抗體的產生是B細胞激活和分化的結果,而B細胞的激活和分化往往需要T細胞的協助,抗體是免疫細胞被抗原激活之后的一種產物。本研究中攻蟲后第30d未感染羊的IgG和IgE水平顯著高于感染羊(P＜0.05),結果說明綿羊體內IgG和IgE水平升高機體對細粒棘球蚴的抵抗力增強。感染羊IgM水平在攻蟲后第7d顯著高于攻蟲0d(P＜0.05),這與 Wenbao Zhang〔5〕等報道的棘球蚴感染早期就可檢測到IgM的結果一致。IFN-γ是由抗原誘生的Th1型細胞因子,在抗寄生蟲感染的防御機制中主要通過增強巨噬細胞吞噬功能和限制細胞內寄生原蟲的增殖發育等方式控制感染。IFN-γ可促進Th1細胞成熟,通過激活巨噬細胞殺傷蟲體、抑制包蟲組織的生長,試驗中IFN-γ水平在攻蟲后第21d、30d未感染羊顯著高于感染羊(P＜0.05),表明綿羊體內IFN-γ水平升高對細粒棘球蚴的抵抗力顯著增強。

由于寄生蟲感染會引起顯著的細胞炎性反應,本研究分析了細粒棘球蚴感染中各種粒細胞的變化。感染羊的白細胞水平在攻蟲后第21d顯著高于攻蟲0d(P＜0.05),說明細粒棘球蚴感染后白細胞會大量增殖來抵抗感染。未感染羊的淋巴細胞在攻蟲后21d、30d顯著高于感染羊,說明淋巴細胞在抗感染的寄生蟲免疫中起重要作用。張琰報道綿羊在感染細粒棘球絳蟲蟲卵后25～30d,與抗體有關的嗜中性粒細胞可殺死細粒棘球絳蟲蟲卵。感染羊嗜中性粒細胞在攻蟲后第21d時顯著高于未感染羊,可能與這種殺傷機制有關。

〔1〕Rickard MD,Williams JF.Hydatidosis/cysticercosis：immune mechanisms and immunization against infection〔J〕.Adv.Parasitol,1982,21：229 296.

〔2〕Dempster RP,Berridge MV,Harrison GB,et al.Echinococcus granulosus：development of an intermediate host mouse model for use in vaccination studies 〔J〕.Int J Parasitol,1991,21：549-554.

〔3〕Gill HS.Cell-mediated immunity in Merino lambs with genetic resistance to Haemonchus contortus〔J〕.Int J Parasitol,1994,24：749-756.

〔4〕Rothw EL,Gramzinski RA,Elaine R,et al.Avian Coccidisis：Changes in intestinal lymphocy te populations associated with the development of immunity toE.maxina〔J〕.Parasite Immunology,1995,l7：525-533.

〔5〕Zhang WB,Li J,Mcmanus DP.Concepts in immunology and diagnosis of hy datid disease〔J〕.Clinical Microbliology Reviews,2003,16(1)：18-36.