雞朊蛋白序列分析及結構特征探究*

2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室,蘭州 730046

朊蛋白(Prion protein,PrP)是由宿主常染色體上單拷貝基因的單個外顯子編碼的一種高度保守的細胞膜糖蛋白。“唯蛋白”假說(protein only)認為傳染性海綿狀腦病(TSE)的致病因子是由動物體PrP基因編碼的細胞型朊蛋白(PrPC)憑借其部分α螺旋重新折疊成β-片層而轉變成致病型的PrPSc組成的〔1〕。但至今關于PrP三級結構轉換機理和構象病的產生機制仍不清楚。雞是最早發現的含有PrP基因的鳥類〔2〕,然而關于雞(Ch)PrP序列及結構的相關研究很少。因此,本研究通過對羅曼雞PrP基因克隆測序,對所得的ChPrP基因序列和其它物種PrP基因比對分析,獲得基于PrP基因的物種遺傳信息,進而推導朊蛋白病種間屏障的形成機制。并參考已有的關于ChPrP高級結構的核磁共振(NMR)數據,利用生物信息學軟件對ChPrP基因推導的氨基酸序列深入分析,獲得ChPrP結構特征,推測可能參與構象轉變的結構區域。進一步通過和哺乳動物(人)PrP高級結構相比較,分析其差異性,推測鳥類不感染朊蛋白病的結構基礎。

1 材料與方法

1.1 血樣 無菌采取8只健康羅曼雞的新鮮血液,以抗凝劑抗凝。

1.2 試劑 基因組DNA提取試劑盒(Genome DNA Extraction Kit),EX Taq DNA聚合酶,DNA凝膠回收試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0),pMD18-T Vector。

1.3 引物的設計和合成 利用Primer Premier 5.0軟件,根據已報道的雞PrP基因cDNA及基因組序列,針對該基因開放閱讀框(ORF)上游、下游保守序列設計兩對特異引物。引物由Invitrogen公司合成。上游引物 F2 5′-CAAAAGCGAGGACAAGGAAC-3′下游引物 R2 5′-GCTGGGGTCAAGGCTACAAC-3′上游引物 F1 5′-GATGCT TGATTTCGGTGGAA-3′下游引物 R1 5′-CGTGCTTGAAGTTGGTTTTGT-3′

1.4 總DNA的提取 全血DNA提取按TIANGEN公司基因組提取試劑盒方法進行。

1.5 朊蛋白基因的PCR擴增 反應體系50μ L,其中總 DNA 4.0μ L 、EX TaqDNA 聚合酶 25μ L 、引物(10 pmol/L)各 2.4 μ L、加滅菌蒸餾水至 50μ L。反應條件,第一步,94℃5 min;第二步,94℃45 s,58℃/56℃45 s,72℃45 s,共進行35個循環;第三步,72℃8 min。

1.6 目的基因克隆 PCR產物的電泳檢測和回收PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,參照標準DNA Marker進行擴增DNA片段大小判定,如與預計目的DNA片段大小一致,則以DNA凝膠回收試劑盒回收目的 DNA片段。按 TaKaRa公司的pMD18-T Vector和E.coliDH5αCompetent Cell使用說明進行目的DNA片段的連接和轉化,劃線接種在含有氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板上培養后,挑選白色菌落并接種在 LB液體培養基中培養。

1.7 重組質粒的測序 由大連寶生物工程有限公司完成。

1.8 序列及結構分析利用各種生物信息學軟件進行序列分析及結構預測。

2 結 果

2.1 PrP基因的PCR擴增 以8只羅曼雞全血DNA為模板,設計兩對特異性引物進行PCR擴增,經瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得兩組分別約482bp和621bp的預期片段見圖1。

圖1 ChPrP基因的PCR擴增產物電泳1-8：PCR 產物 ;M ：DNA marker DL2000Fig.1 Electrophoresis of PCR-amplified products1-8：PCR products;M ：DNA marker DL2000

2.2 PrP基因測序結果及分析 通過對兩組測序結果拼接獲得1015 bp的片段,包含了ChPrP基因的完整編碼區及部分內含子序列。序列分析表明8只羅曼雞PrP基因ORF有兩處發生堿基置換(243C→T,296A→G),其中243位點為同義碼替換。通過在線 BLAST(NW_001471575)發現ChPrP基因位于雞的第22號染色體。

2.3 雞朊蛋白高級結構預測

2.3.1 一級結構和理化性質 應用ProtParam、TMpred、TMHMM等工具分析ChPrP基因推導氨基酸序列表明,ChPrP多肽由273個氨基酸組成,相對分子質量為29 948.7,理論 PI值為 9.05,正電荷占較高組分,總平均親水性為-0.573。8只羅曼雞PrP多肽N-端均有7個富含Pro的六肽重復PHNPGY/PQNPGY,并在99位點發現Q→R突變見圖2。

2.3.2 雞朊蛋白二級結構和三級結構特征 應用PredictProtein工具分析顯示：ChPrP二級結構由34.1%的螺旋,8.8%的折疊及57.1%的無規卷曲組成。N-端約100個殘基形成無規則區域,C-端形成保守的球狀結構域。N-糖基化位點位于194,209和218位點。191,238位點的氨基酸殘基可形成二硫鍵穩定構象。位于99位點的Q→R突變對ChPrP二級結構無明顯影響見圖3。

應用SWISS-MODEL/SWISS-PdbView等工具,按照同源建模法構建出ChPrP和人(Hu)PrP C-端約 100個殘基的區域(圖 4),如圖顯示ChPrPC-端是由3個α-螺旋(157-167,185-200,219-246)和2個短的反向平行β-折疊(142-144,174-176)組成的球狀結構域;HuPrP C-端亦由3個α-螺旋(144-152,173-189,195-223)和2個短的反向平行β-折疊(129-131,161-163)組成,且二者二級結構組成元件相似。

圖4 ChPrP和HuPrP三級結構模擬圖Fig.4 The simulated three-dimensional structures of ChPrP and HuPrP

3 討 論

3.1 PrP基因進化關系與朊蛋白病種間屏障的形成PrP基因作為一個古老而保守的基因廣泛存在于各種生物體中。構建基于PrP基因的系統進化樹見圖5,分析顯示ChPrP基因同其他禽類PrP基因進化關系較近,與兩棲、爬行類位于同一進化分支,同源程度較高,而與哺乳動物處于不同的進化分支,進化關系較遠,基于PrP基因的進化關系與物種親緣關系相符。研究發現,朊蛋白病發生的一個重要表現是具有種間屏障現象,應用嵌合朊蛋白轉基因老鼠實驗證實,受體和供體物種同源程度高低決定著朊蛋白病的種間屏障〔3〕。但是朊蛋白病作為一種構象疾病,單純的氨基酸序列同源程度高低并不能完全決定其種間屏障的產生,例如：人PrP基因同牛、羊PrP基因同源程度相近,已發現多例因食用患病牛而感染TSE的病例,而羊瘙癢病存在已久,卻未發現一例因食用病羊而感染 TSE的病例。通過NM R分析發現,人PrP高級結構與朊蛋白病抗性羊(ARR)PrP構象相似〔4〕,據此認為 PrP構象同源性高低在一定程度上決定著該病種間屏障的產生。而PrP構象主要是由C-端保守的球狀結構域決定的,位于球狀結構域末端的高變區可能是“蛋白X”的特異性結合表位,“蛋白X”作為分子伴侶介導PrPC轉變為 PrPSc,進而影響 PrP種間屏障的形成〔5〕。另外,PrP表面電荷分布的不同,可作為重要的構象特征影響種間屏障的產生〔6〕。總之,朊蛋白病種間屏障的產生不僅僅是由物種同源程度或PrP基因序列同源性高低來決定,其構象同源程度和穩定性,以及與構象形成相關的一些輔助因子起關鍵作用。

圖5 68個物種的PrP基因推導氨基酸序列系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree for PrP amimo acid sequence of 68 species of animal

3.2 ChPrP高級結構特征以及與構象轉變的關系朊蛋白病作為一種致死性的構象疾病,確定其致病機理的關鍵在于了解PrP的構象轉變機制。盡管已知的大多數脊椎動物都含有PrP基因,但是朊蛋白病僅見于哺乳動物,尚未發現非哺乳動物PrP出現致病型構象。分析顯示,哺乳動物PrP基因間相似程度在90%以上,ChPrP基因同哺乳動物相比只有30%相同〔7〕,然而ChPrP N-端六肽重復元件PHNPGY和HuPrP N-端八肽重復元件PHGGGWGQ在氨基酸組成上十分相似,二者主要由非極性氨基酸組成,均含有一個芳香族氨基酸和一個極性氨基酸。分析ChPrP和HuPrP高級結構模型發現,二者C-端分子構象相似,均為由2個短的反向平行β-折疊和3個α-螺旋組成的結構域,且組成的二級結構元件長度及位置基本相同,ChPrP C-端192,237位點的半胱氨酸殘基能夠形成二硫鍵,連接α 2和α 3以穩定其球狀結構域構象,與NMR結果相同〔8〕,而HuPrP模型C-端構象與NMR結果不同〔9〕,其179,214位點的半胱氨酸殘基未形成二硫鍵,C-端結構域較為松散。據此推想至今未發現ChPrP致病型結構可能是由于ChPrP形成的構象更加穩定,不易發生變化。然而應用MD分析Hu-PrP和ChPrP結構穩定性發現,從整個分子來看,二者構象熱穩定性并無顯著差異〔10〕。顯然PrP自身的穩定性并不能完全影響其構象變化,“蛋白X”、DNA、RNA、金屬離子等輔助因子在PrP構象轉變過程中發揮著重要作用〔11-12〕。通常“蛋白X”被認為是介導PrPC轉變為PrPSc的分子伴侶,它能夠結合PrP C-端高變區發揮作用〔13〕。而且與哺乳動物PrP構象不同,ChPrP N-端串聯重復區形成穩定的環狀構象,結合銅離子的能力明顯弱于哺乳動物,甚至成熟的ChPrP不能結合銅離子,這一點有利于維持ChPrP構象穩定性〔14〕。除此之外,PrP構象還受到多種環境因素調控,研究發現溫度、pH等的變化也會影響PrP構象的形成〔15〕,據此認為,PrP構象轉變是由多種因素共同作用產生的,不同的環境可能造就不同構象的PrP,那么同一生物體內是否可能含有不同構象的PrP,有待進一步研究。

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