沙門菌分離技術關鍵點的研究和評價*

胡雪明,楊蘭萍,金匯明,許學斌,冉 陸,闞 飆

2.上海市盧灣區疾病預防控制中心,上海 200025;

3.上海市疾病預防控制中心,上海 200336;

4.中國疾病預防控制中心,北京 102206

上世紀70年代的球磨培養基生產技術研發成功為國內實驗室提供了與國際接軌的低成本沙門菌分離材料,使之能按照國標或行標開展沙門菌檢測項目。90年代始,因持續升溫的食源性疾病研究推動了對沙門菌分離材料和方法的創新,反觀國內培養基產品滯后、原材料品質下降和腹瀉患者口服抗菌藥物史等多因素影響著實驗室檢測和監測沙門菌的敏感性。為提升實驗室在腸道病原菌診斷中的影響力,維護國家參與全球沙門菌監測(GSS)中的利益,我們對沙門菌新型與傳統培養基的效果評價基礎上優化分離關鍵點技術,并驗證、評價其可推廣性。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株 敏感性測試菌株包括 26株非傷寒沙門菌和16株傷寒副傷寒沙門菌;特異性測試菌株148株均來自上海市疾病預防控制中心(CDC)菌種保藏室〔1〕。

1.2 試劑和儀器 亞硒酸煌綠增菌液自行配置〔2〕;羅伯特增菌液(RVS)和木糖賴氨酸膽酸鹽瓊脂平板(XLD,Oxoid,英國);CHROMagarTM沙門菌顯色瓊脂平板(CAS)(上海科瑪嘉微生物技術有限公司);沙門菌分型診斷血清118種(S&A,Ltd,泰國);API-ATB生化鑒定儀(法國生物梅里埃公司);亞硒酸鹽增菌液(SF)、沙門-志賀平板(S.S)、武漢S.S瓊脂平板(WS)、Hektoen平板(HE)、腸道雙支糖綜合鑒別管和其他輔助生化鑒定試劑(上海市疾病預防控制中心試劑供應中心)。以上試劑避光10℃以下保存,均在有效期內使用。

1.3 敏感性與特異性 實驗菌株經血平板純化后挑取單個菌落轉種富營養肉湯36℃過夜培養后調至0.5麥氏比濁管濃度,取 10μL 種于 CAS、WS、S.S、HE、XLD 劃線分離,36℃培養24h記錄平板菌落生長：判斷典型陽性菌落CAS為酒紅色圓而濕潤菌落;WS、S.S、HE、XLD皆為中心黑色(硫化氫陽性)的半透明、原色、濕潤菌落;反之陰性。標本分離平板若符合典型菌落生長者假設沙門菌陽性,挑取≤3個菌落接種腸道雙支糖綜合鑒別管36℃培養24h后生化符合(甘露醇+、葡萄糖+、尿酶-、蔗糖-、動力+、靛基質-、硫化氫+)者,經血清分型結合生化鑒定的“金標準”方法報告沙門菌血清型。統計敏感性和特異性。

1.4 選擇性增菌液與平板組合使用的敏感性 回顧性在收集不同時期、不同標本(預防性職業體檢糞便肛拭2 517件、食品增菌標本303件、腹瀉病人糞便肛拭870件)直接平板分離、增菌液與平板配伍單盲檢測的敏感性,見表1。2004年本市盧灣區疾病預防控制中心(CDC)實驗室使用單盲法隨機對流行與非流行季節的各1 000份預防性體檢糞便標本比較SF和SBG分別與WS和CAS配伍檢測的敏感性。

1.5 優化方法的驗證 GSS監測項目：2005年6-11月上海市CDC使用 SBG-XLD/CAS(優化方法1)檢測870份腹瀉病人糞便標本的沙門菌月度陽性率為本底依據,制定《上海市沙門菌監測(GSS)方案.2006年》〔3〕培訓各監測點CDC實驗室人員檢測盧灣(后改為黃浦)、長寧、金山、浦東新區共設置的12家監測點醫院腸道門診的腹瀉病人糞便標本,其中一、二、三級醫院各4家。優化方法1與傳統方法的比較：統計2006和2007年靜安區預防性體檢糞便肛拭標本經傳統方法(SF-WS)檢測的沙門菌月度陽性率為基線值,以優化方法1替代檢測2008年度靜安區預防性體檢肛拭標本,比較兩法的月度陽性率。

1.6 優化方法在臨床實驗室的室間控制和方法學評估2008年4月培訓GSS監測點8家二、三級醫院的腸道門診和微生物實驗室醫、技人員,2008年5月始,臨床實驗室使用SBG-XLD(優化方法2)和4個區CDC實驗室使用優化方法1各自對腹瀉標本進行平行檢測。CDC根據各醫院每月菌株符合數給予質量督導和階段性效益評估。

2 結 果

2.1 平板的敏感性和特異性 42株傷寒和非傷寒沙門菌在CAS、WS 、S.S 、HE、XLD 上的總敏感性分別為 100%、57.1%、61.9%、47.6%、85.7%,3 種以單純糖-指示劑為原理的平板(WS、S.S、HE)的假陰性絕大多數為傷寒、副傷寒沙門菌和部分非傷寒沙門菌,XLD上的假陰性則以傷寒、副傷寒沙門菌為主;148株非沙門菌在 CAS、WS、S.S、HE 、XLD上的總特異性分別為 96.6%、93.2%、93.92%、93.2%、92.6%。CAS上的假陽性有2株大腸埃希菌、1株溶血不動桿菌、1株銅綠假單胞菌、1株近平滑假絲酵母菌,培養時間延長至48h后假陽性菌落或挑之有粗糙感或在色度和濕潤度上均有別于典型菌落。其余平板的假陽性菌落多由產硫化氫的7株枸櫞酸桿菌和少數腸桿菌(1株遲緩愛德華腸桿菌、1株雷氏普魯菲登腸桿菌、1株奇異變形桿菌、1株蜂房哈夫尼亞腸桿菌)及1株溶血不動桿菌產生〔1〕。

2.2 增菌液和平板配伍檢測的敏感性 不同時期多基于糞便標本為主的不同增菌液之間和一種增菌液與不同平板單盲法檢測沙門菌的敏感性顯示CAS和 XLD優于 WS、S.S、HE;但臨床肛拭標本用CAS直接檢測的敏感性也僅為23.0%,說明對肛拭為主的糞便標本增加選擇性增菌是必要步驟;而傳統增菌液與平板配伍：SF-S.S的敏感性為0和35.9%,更換了SBG增菌液后用類似的WS平板檢測敏感性也可達到71.8%,而臨床肛拭標本用SBG增菌后用 CAS、XLD合并檢測的總敏感性為100%,其中CAS以94.4%的敏感性優于XLD的89.7%。增菌后的平板分離效果顯示,SBG效果最佳,RVS次之,國內常用的SF較差,見表1。

2.3 方法驗證 2005年6-11月和2006年4月-2009年7月,優化方法1檢測腹瀉病人和GSS標本數和月度陽性數見表2,根據陽性率作圖1：5年中檢測沙門菌的月度陽性率符合腸道傳染病在流行季節呈正態分布的曲線特征,各年的月度陽性率間的波動度相對較小,最高月度陽性率為2008年9月(6.9%),年度陽性率水平呈較低的是2006年,相對陽性率最高為2009年,高峰期保持在8-10月的5%～7%陽性率水平。

優化方法1檢測2008年度靜安區預防性體檢肛拭標本共分離沙門菌129株(0.4%,129/29 687),分別是2006年22株(0.08%,22/29 005)的8倍和2007年12株(0.04%,12/30 577)的10倍。據3年中沙門菌月度陽性率繪制曲線將2008年與2006、2007年的結果進行比較,見圖2：在6-10月的流行季節,2008年的月度陽性率是2006、2007年的2～10倍;其他非流行季節,2008年也均明顯高于2006和2007年同期的月度陽性率。

表1 5種沙門菌選擇性平板在菌株及3種增菌液配伍檢測的敏感性(%)〔1,4〕Tab.1 The susceptibility test by stock of strainsand combiningthree Salmonella selective enrichment broth on five selective medium

表2 2005-2009年月度檢測腹瀉標本數和沙門菌陽性數Tab.2 The nember of diarrheic specimen and isolates Salmonella in mouthly surveillance(2005-2009)

2.4 優化方法的室間控制 比較2008年5月-2009年8月上海市8家二、三級醫院實驗室用優化方法2和區CDC實驗室使用優化方法1平行檢測GSS標本的月度陽性菌株數,區CDC實驗室檢菌數為197高于臨床實驗室的155(假設CDC檢測敏感性為100%則醫院的敏感性為78.7%)。通過市、區CDC加強兩級督導尋找產生誤差原因、糾正認為因素和臨床實驗室對檢測流程的熟練度逐漸增加等原因,使2009年兩者的平行檢測差距同比小于2008年同期,見圖3。2009年8月高峰期出現的較大差異現象經調查為黃浦區中心醫院腸道門診人員更替造成的偏倚。在8家二、三級醫院中以上海市第九人民醫院的40株和黃浦區CDC的45株的檢測符合率最高,敏感性達到88.9%,高于其他臨床醫院實驗室結果,見圖 4。優化方法 2因未使用CAS其成本僅為方法1的1/3,8家臨床醫院使用優化方法2歷經2年檢測的總敏感性為78.7%,其中第九人民醫院最高88.9%的敏感性與前期2005年89.7%的結果接近。

3 討 論

2008年通過國家大疫情網絡直報的感染性腹瀉(丙類傳染病)人數較歷史同期水平出現大幅增長,但自臨床實驗室診斷并報告為沙門菌的(多數沒有分型)全國僅有280余例(其中包括上海市金山區1例食源性暴發的90多例)。通過2005-2009年的GSS監測數據證明,沙門菌在本市腸道病流行季節可達到5%～7%的臨床分離率,說明國內多數臨床醫院腸道門診可能存在采樣率不足和實驗室檢測敏感性嚴重偏低的問題,也為臨床實驗室改革沙門菌檢測現行標準提供了客觀數據〔5〕。

影響沙門菌常規檢測的因素有很多,本次的平板敏感性測試證實不同非傷寒沙門菌株間產硫化氫表型有很大差異,故可解釋S.S在菌株測試和標本分離敏感性低的問題,緣于標本中大量產硫化氫的腸肝菌干擾嚴重降低平板篩檢的陽性預測值、增加無效鑒定的人工和花費。CAS作為第三代沙門菌顯色平板因含有雙酶底物能明顯克服產硫化氫等非沙門菌的干擾,提高平板篩檢的準確性、減少工作量。除在體檢標本分離到傷寒沙門菌外,還能避免少數硫化氫陰性的變異沙門菌引起暴發病例的漏檢,唯一的缺點是價格較昂貴〔1,7〕。

選擇性增菌液中的靶菌濃度低于106cfuml可能無法用平板分離到。SF因不可高壓、需避光保存和最佳增菌時間為8～12h等苛刻條件使其受國外用戶的限制;RVS現多用于食品沙門菌增菌;SBG配方中增加了修復損傷沙門菌的能力,RVS和SBG的最佳增菌時間皆為18～22h,即培養過夜后菌量基本都能達到最大值(109cfuml)易被平板篩檢〔8〕。另外,由于SBG中添加的磺胺類藥能提高抑制雜菌的能力也間接提高平板分離靶菌的敏感性。數據表明,使用SBG增菌后即使用WS平板分離的敏感性也可達到71.8%,說明增菌液的優化配伍可以提高傳統平板分離的敏感性,間接降低檢測成本。

沙門菌選擇性增菌液和平板分別是影響分離敏感性的主次因素,兩者互為因果且互為影響,在確認能夠滿足有效增菌的前提下進行平板分離是沙門菌分離技術的關鍵點。為國內高端的專業實驗室提供滿足不同能級沙門菌檢測需要。

包括分子生物學、免疫學方法在內的諸多“快診”方法已被應用于突發公共衛生事件的實驗室應對,但源于食品加工者導致食源性暴發和潛在的、多點散發的沙門暴發病例的防控仍需高度依賴眾多公共衛生和臨床實驗室基于操作簡單、敏感、高效的常規方法所建立的常態監測網絡〔3,9〕。

(對參與項目的上海市第九人民醫院孫康德;黃浦區中心醫院周耀忠;東方醫院李永明;仁濟醫院浦東分院汪雅萍;金山醫院吳麗桂;金山區中心醫院沈秀珍;長寧區中心醫院徐偉紅;同仁醫院徐斌等微生物檢驗同仁在此一并致謝!)

〔1〕許學斌,顧寶柯,楊蘭萍,等.5種沙門菌分離培養基的應用和比較〔J〕.中國衛生檢驗雜志,2005,15：773-775.

〔2〕Parks LC.Handbook of microbiological media〔M〕.2th.CRC Press,Inc,2000：Boca Raton,Fla.1476.

〔3〕朱超,許學斌.沙門菌血清型診斷〔M〕.上海：同濟大學出版社,2009：368-394.

〔4〕許學斌,顧寶柯,陳敏,等.沙門菌檢測方法的優化〔J〕.檢驗醫學,2007,22：677-680.

〔5〕顧寶柯,袁政安,金匯明,等.上海市沙門菌病流行特征分析〔J〕.環境與職業醫學雜志,2008,253：245-247.

〔6〕衛生部.細菌性和阿米巴痢疾診斷標準(WS287-2008).

〔7〕許學斌,袁政安,金匯明,等.上海市山夫登堡沙門菌流行特征和分子分型研究〔J〕.中華流行病學雜志,2009,30：933-937.

〔8〕Feder I,Nietfeld JC,Kelly B.Evaluation of enrichment techniques for the isolation ofSalmonellacholeraesuis from swine feces〔J〕.J Microb Methods,1998,33：143-151.

〔9〕Kimura AC,Palumbo MS,Meyers H,et al.A multi-state outbreak ofSalmonellaserotype T hompson infection from commercially distributed bread contaminated by an ill food handler〔J〕.Epidemiol Infect,2005,133：823-828.

〔10〕Luo YP,Li JY,Ma Y,et al.Isolation and characterization of nontyphoidSalmonellafrom hospital food handlers in Beijing,China〔J〕.J Food Safety,2009,29 ：414-423.