間日瘧原蟲乳酸脫氫酶編碼區全長基因的克隆、序列分析及線性B細胞表位預測*

方 強,夏 惠,王雪梅,齊文娟,常雪蓮,高 琪

2.江蘇省寄生蟲病防治研究所、衛生部寄生蟲病預防與控制技術重點實驗室,無錫 214064

瘧疾是一種嚴重危害人類健康的感染性疾病,目前全球40%的人口生活在瘧疾流行區,有109個國家的約33億人口受到瘧疾感染的威脅,約2.47億人罹患瘧疾,死亡人數達88.1萬〔1〕。間日瘧原蟲是對人類危害僅次于惡性瘧原蟲,據估計全球受到間日瘧原蟲感染威脅的人口高達26億〔2〕,而每年約有0.8-3億人因間日瘧原蟲感染而出現急性發作〔3-5〕。在我國,估計目前每年有70萬左右瘧疾患者,主要是間日瘧患者,但在部分地區有間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲的混合流行〔6-7〕。瘧疾的診斷是瘧疾防治工作中的一個重要環節,當前瘧疾的發病率和死亡率難以控制的一個重要原因就是在瘧疾流行區缺乏有效的診斷和治療手段。依據全球瘧疾控制方案的規定,WHO全球方案執行研究組特別強調早期診斷和正規治療的重要性〔8〕。鑒于病原檢測方法及PCR方法在瘧疾診斷中均存在一定的局限性,免疫快速診斷方法近年來在瘧疾防治研究領域得到了高度重視。

瘧原蟲乳酸脫氫酶(1actate dehydrogenase,LDH)是糖酵解途徑的末端酶,在整個紅內期均存在,是瘧原蟲生長所必須的酶。由于其具有不同于人類紅細胞 LDH的獨特理化和免疫化學性質,故在瘧疾診斷和新藥篩選方面具有重要的應用價值。目前國內外對于惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶已經有較多的研究,已有以其為診斷靶抗原的診斷試劑投入現場使用,而對于間日瘧原蟲乳酸脫氫酶的研究卻較為滯后。直到2004年Brown WM與Turgut-Balik D先后報道了Salvador I株LDH的部分基因序列和Belem株的LDH 全基因序列〔9-10〕,國內亦于06年報道了云南的PvLDH 的部分序列〔11〕。但中國PvLDH編碼區全長基因序列卻一直未見報道。我國的瘧疾流行以間日瘧為主,克隆可望作為診斷靶抗原的PvLDH編碼區全長基因對于建立新的瘧疾快速免疫診斷方法,進行瘧疾防治防治有著重要的意義。為此,我們采用基因克隆技術,擴增了來自中國安徽間日瘧原蟲LDH編碼區全長基因,將其克隆至pMD18-T載體進行序列測定,并利用生物信息學在線工具對序列進行分析并做B細胞表位預測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 間日瘧原蟲 采自安徽省蚌埠市經厚薄血片染色鏡檢和PCR檢查確診為單純間日瘧原蟲感染,尚未進行藥物治療,年齡≥18歲,非孕婦且體溫≤39.5℃的間日瘧患者。在告知實驗目的并簽署知情同意書后靜脈采血5～10mL,肝素抗凝,37℃水浴保溫,2h內運送至實驗室。

1.1.2 菌種和質粒 pMD18-T載體為T aKaRa產品,大腸桿菌DH5α由本室保存。

1.1.3 試劑 TRIzol試劑為 Invitrogen公司產品,cDNA合成試劑盒為Fermentas公司產品(#K1621),PrimeSTARTMHS DNA聚合酶為 TaKa-Ra產品,Tap DNA 聚合酶、dNTP、100bp plus DNA Ladder和 1kb DNA Ladder均為 Fermentas公司產品。膠回收試劑盒、質粒小抽試劑盒為Axygen公司產品。其余試劑均為國產分析純。

1.1.4 PCR引物 根據GenBank數據庫中間日瘧原蟲Belem株 LDH基因序列(登錄號：DQ060151)設計一對引物,上游引物為ATG ACG CCG AAA CCC AAA ATT G,下游引物為：TTA AAT GAG CGC CTT CAT CCT TT T AG,引物由上海英駿公司合成,PAGE純化。

1.2 方法

1.2.1 間日瘧原蟲的濃集和總RNA的提取 將間日瘧患者血樣分離血漿后以不完全1640稀釋為20%紅細胞懸液,以60%Percoll濃集含蟲紅細胞,按T rizol試劑盒說明書提取細胞總RNA,分別用紫外分光光度法測定總 RNA的純度和濃度,1.2%TBE瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量,選取高質量的RNA進行逆轉錄。

1.2.2 總RNA的逆轉錄 按照Fermentas公司的RevertAidTM第一鏈 cDNA合成使用說明書操作：其中在20 μ L反應體系中,間日瘧原蟲總 RNA量為 3～ 4 μ g,oligo(dT)18為引物 ,M-MuL V 逆轉錄酶進行逆轉錄,所得間日瘧原蟲cDNA立即進行PCR或-20℃保存待用。

1.2.3 聚合酶鏈反應(PCR)以獲得的間日瘧原蟲cDNA為模板,擴增反應體系總體積為 50 μ l。擴增反應條件為：預變性 94℃5 min;然后94℃1 min,56℃1 min,72 C 1 min,30個循環;最后 72℃延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗擴增產物。

1.2.4 PCR產物的TA克隆 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后以膠回收試劑盒回收,加A尾,根據使用說明書要求與pMD18-T載體連接,將連接產物轉化 DH5α感受態細胞,平鋪入含 Amp 、Xgal、IPTG的LB瓊脂平板進行藍白斑篩選。

1.2.5 克隆鑒定及序列測定 分別挑取多個白色單菌落,放入2 mL含Amp的LB液體培養基中,37℃＞200 r/min 8 h,提取質粒DNA。以提取的質粒DNA為模板,分別以上述引物進行PCR擴增鑒定陽性克隆;根據T載體和目的DNA所含的酶切位點,分別對提取的質粒DNA進行單雙酶切鑒定。將經鑒定的陽性克隆菌送上海生工進行序列測定。

1.2.6 序列分析 利用NCBI提供的生物信息學在線工具對測序結果進行同源性分析。

1.2.7 B細胞表位預測 利用在線工具http：//tools.immueepitope.org/tools/bcell/iedb_input對推導的PvLDH氨基酸序列進行分析,預測其二級結構、表面可及性、親疏水性、抗原性、蛋白柔韌性,綜合預測其線性B細胞表位,并與據PfLDH氨基酸序列預測的線性B細胞表位進行比較分析,預測PvLDH特異性線性 B細胞表位;并分析預測的PvLDH特異性線性B細胞表位在PvLDH蛋白空間結構的定位。

2 結 果

2.1 總RNA的質量 提取的總RNA A260/A280為1.8-2.0,瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RNA條帶清晰銳利,無降解彌散,質量較好。

2.2間日瘧原蟲LDH編碼區全長基因的擴增 用兩條引物從制備的中國安徽間日瘧原蟲RNA逆轉錄產物擴增LDH編碼區全長基因,PCR產物經1%瓊脂糖電泳顯示在約950bp處有一特異性擴增條帶,片段大小與預期結果(951bp)一致,見圖1。

圖1 間日瘧原蟲LDH PCR產物瓊脂糖電泳分析M：DNA 標準;1：PCR產物Fig.1 Agarose gel electrophoresis for PCR products of PvLDHM：DNA marker;1：PCR products

2.3 LDH編碼區全長基因重組質粒的鑒定 挑選的陽性克隆菌落PCR擴增出951bp片段,提取質粒做單酶切則見1條約為4 000bp條帶,雙酶切后見2條分別約為3 000bp和1 000bp條帶。表明目的基因已成功克隆入T載體,見圖2。

圖2 pMD18-PvLDH重組質粒的酶切及PCR鑒定M：DNA標準;1：pMD18-PvLDH重組質粒 HindⅢ和BamHⅠ雙酶切;2：pMD18-PvLDH 重組質粒 HindⅢ單酶切;3：pMD18-PvLDH重組質粒PCR產物Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18-PvLDH by restriction digestion and PCRM：DNA marker;1：recombinant plasmid pMD18-PvLDH digested by HindⅢ and BamHⅠ;2：recombinant plasmid pMD18-PvLDH digested by HindⅢ;3：PCR products usingrecombinant plasmid pMD18-PvLDH as template

2.4 序列測定及同源性分析 測定的中國安徽間日瘧原蟲LDH基因的全編碼區基因長為951bp,無內含子,A+T/G+C含構成比為509∶442,預測編碼316個氨基酸,分子量為34kD。該基因已經上傳GenBank,收錄號為GU078391。以 BLASTn對獲得的中國安徽PvLDH基因序列進行同源性分析,結果表明我們獲得的中國安徽PvLDH與間日瘧原蟲Sal-I株和Belem株LDH基因比較同源性達99.9%(950/951),僅在666位處發生 1個G→C點突變,且其編碼氨基酸無變化,為同義突變。運用BLASTp對中國安徽PvLDH基因推導的氨基酸序列進行同源性分析,結果顯示安徽PvLDH氨基酸序列與間日瘧原蟲Sal-I株和Belem株LDH同源性為100%,與其它瘧原蟲LDH的同源性分別為：諾氏瘧原蟲LDH預測序列為97%(307/316)、惡性瘧原蟲、伯氏瘧原蟲、約氏瘧原蟲均為90%(285/316)、夏氏瘧原蟲為88%(279/316)、三日瘧原蟲LDH已知序列為 90%(272/299)、卵形瘧原蟲LDH已知序列為88%(265/299)。而與艾美球蟲、弓形蟲、巴貝蟲、泰累爾犁漿蟲等其它原蟲的同源性均小于60%。

2.5 線性B細胞表位分析 利用在線工具分析了推導的PvLDH氨基酸序列的二級結構、表面可及性、親疏水性、抗原性、蛋白柔韌性,并據此預測其線性B細胞表位12個線性B細胞表位見表1、圖3,與據PfLDH氨基酸序列預測的線性B細胞表位,見表2、圖3,分析比較,獲得一間日瘧特異性線性B細胞表位：KITDEEVE,位于氨基酸序列的 208-215位。通過對預測表位在PvLDH蛋白空間結構中位置的分析,顯示該預測表位位于PvLDH表面,見圖4,與PvLDH蛋白(2A92)表面氨基酸匹配率為100%。

3 討 論

瘧原蟲乳酸脫氫酶(pLDH)同宿主動物LDH在理化、免疫學特性和酶學方面有很大的差異。在催化乳酸生成丙酮酸反應中,pLDH能夠迅速地利用NAD類似物3'-乙酰吡啶NAD(3-acetyl pyridine analog of NAD,APAD)作為輔酶,而紅細胞LDH(LDHr)在APAD存在時參與這一反應速率很慢〔12〕;同時,pLDH 還具有種、屬特異性,而且瘧原蟲的無性期和配子體均可產生該種酶,因而是檢測瘧原蟲理想的靶抗原〔13〕。以惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶作為惡性瘧診斷的標靶的快速診斷試劑已經在世界范圍內得以廣泛的應用,并取得良好的效果〔14-17〕。對于間日瘧原蟲目前尚無特異性快速免疫診斷試劑〔17〕。而我國瘧疾流行則以間日瘧為主,因此,加強間日瘧診斷標靶的研究具有十分重要的現實意義。鑒于我國的間日瘧原蟲的LDH全長基因尚未見報道,我們對克隆了分離自安徽間日瘧流行區的LDH全長基因,并進行了序列分析。

圖3 間日瘧原蟲LDH(a)和惡性瘧原蟲LDH(b)預測線性B細胞表位序列。黃色區域為預測的表位。Fig.3 B cell linear epitopes prediction of PvLDH(a)and PfLDH(b).The epitopes prediction shown in yellow

表1 間日瘧原蟲LDH和惡性瘧原蟲LDH預測線性B細胞表位序列Tab.1 B cell linear epitopes prediction of PvLDH and PfLDH

圖4 預測的PvLDH特異性線性B細胞表位在PvLDH四聚體的空間位置黃色區域為預測的PvLDH特異性線性B細胞表位KITDEEVEA、B、C、D四圖為 PvLDH 四聚體逆時針旋轉,旋轉90°Fig.4 Space location in PvLDH tetramer of the specific B cell linear epitopes prediction of PvLDH The specific B cell linear epitopes predicted of PvLDH show in yellowA,B,C,D show go degree counterclockwise rotations of PvLDH tetramen

本研究顯示克隆的中國間日瘧原蟲安徽株LDH的基因序列與Belem株和Salvador Ι株的基因序列有高度的同源性,核苷酸序列僅有一處點突變,且為同義突變,其編碼氨基酸序列的無改變。同已經登陸于GenBank的其它間日瘧原蟲蟲株(如Belem株和Salvador Ι株)的LDH氨基酸序列一致的現象結合分析,表明不同蟲株間日瘧LDH具有高度的同源性。這種不同蟲株間的間日瘧LDH高度同源性更顯示了其作為瘧疾免疫快速診斷靶抗原的優勢。同時,序列分析也顯示在各種不同種的瘧原蟲LDH間也具有高度的保守性,但與艾美球蟲、弓形蟲、巴貝蟲、人類等的LDH相比,則差異很大。利用免疫快速診斷方法進行瘧原蟲蟲種鑒別診斷的關鍵是獲得種特異性LDH單克隆抗體,而由于瘧原蟲LDH具有高度的保守性,以純化的pLDH天然或重組蛋白免疫動物制備單克隆抗體,則獲得瘧原蟲屬共同抗原表位的單克隆抗體的幾率遠遠高于獲得間日瘧原蟲種特異性單克隆抗體的幾率,篩選制備種特異性LDH單克隆抗體的難度是可以想象的。近年來,隨著生物信息學技術的發展,表位預測手段日趨成熟,所預測表位的成功率大大提高,利用預測表位合成肽制備抗體已經成為一條可行的路線。因此,我們試圖利用生物信息學手段來預測間日瘧原蟲LDH種特異性表位,為制備間日瘧種特異性單克隆抗體做準備。為此,我們對間日瘧LDH進行了線性B細胞表位預測,并與PfLDH線性B細胞表位進行對比分析。結果顯示在2種LDH預測的潛在表位中大部分存在著共同的氨基酸序列,但值得注意的是間日瘧 LDH氨基酸序列的208-215位KITDEEVE形成的B細胞表位在PfLDH不存在。因此,這是一個潛在的間日瘧特異性B細胞表位。然而,目前該潛在的間日瘧特異性B細胞表位僅是通過序列分析預測獲得,盡管通過分析其在PvLDH蛋白上空間位置發現其在PvLDH蛋白表面,為預測結果提供了部分佐證,進一步增加了其作為B細胞表位的幾率,但其是否真正具有抗原性,是否確為一個B細胞表位,還需要通過后續實驗進行驗證。若經證實其確為一個間日瘧特異性B細胞表位,則可以之合成肽免疫小鼠,制備針對該表位的單克隆抗體,建立一種新的檢測間日瘧原蟲的間日瘧特異性診斷方法。

間日瘧原蟲LDH基因的成功克隆和間日瘧特異性B細胞表位的成功預測,使我們有可能通過基因工程技術表達間日瘧原蟲的LDH蛋白或利用合成肽技術合成包含間日瘧特異性B細胞表位的短肽,從而制備間日瘧的種特異性抗體,為實現間日瘧的特異性免疫診斷奠定基礎。

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