我國分離的大腸埃希菌O157∶H7的毒力基因檢測(cè)分析*

王 濤,劉麗云,王 娉,熊衍文,白雪梅,葉長蕓,徐建國

2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206

腸出血性大腸埃希菌(EHEC)O157∶H7是引起人類感染性腹瀉的病原菌,由于可導(dǎo)致患者出血性腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合征(H US)、血栓性血小板減少性紫癜(T TP)等病死率高的疾病〔1〕,因而已成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。大腸埃希菌O157∶H7主要依靠它產(chǎn)生的志賀毒素、溶血素和對(duì)上皮細(xì)胞的粘附素引起人體的損害。其中志賀毒素(Shiga toxin,Stx)包括志賀毒素1和志賀毒素2,是引起人類溶血性尿毒綜合征和血栓性血小板減少性紫癜的主要毒力因子,分別由st x1、stx2基因編碼。而由hlyA和eaeA基因編碼的溶血素和對(duì)上皮細(xì)胞的粘附素也是重要的致病因子。為了解我國部分省區(qū)大腸埃希菌O157∶H7的毒力基因攜帶特點(diǎn),采用PCR方法對(duì)1992-2006年我國部分省區(qū)分離到的大腸埃希菌O157∶H7菌株的特異基因及毒力基因進(jìn)行檢測(cè)分析,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)菌株分離自中國江蘇、安徽、河南、河北、山東、寧夏、天津、云南八個(gè)不同地區(qū)的病人,牛、羊等家畜家禽以及食品和飲用水,并經(jīng)本室系統(tǒng)生化鑒定,O157及H7血清復(fù)核后保存。陽性對(duì)照菌株EDL933及陰性對(duì)照菌株MG1655均由本室保存。DNA提取試劑盒由北京天根公司提供。PCR主要試劑及Taq DNA聚合酶購自T aKaRa公司。PCR儀為Labcycler(SensoQuest)。凝膠成像系統(tǒng)為Gel Doc XR(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 制備DNA模板 按試劑盒方法提取實(shí)驗(yàn)菌株DNA模板,置-20℃保存。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)〔2-6〕,并略作修改,由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物序列及PCR擴(kuò)增條件見表1。

1.2.3 PCR檢測(cè) 以O(shè)157∶H7標(biāo)準(zhǔn)菌株EDL933和MG1655菌株作為陽性及陰性對(duì)照,按照常規(guī)PCR方法,分別用6對(duì)引物擴(kuò)增相應(yīng)DNA片段,取5μ L擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化后,以6對(duì)引物用相同的條件對(duì)345株菌進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 資料統(tǒng)計(jì)與分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,統(tǒng)計(jì)各毒力基因攜帶率,并用SPSS 11.5軟件對(duì)人及不同動(dòng)物之間毒力基因的攜帶率差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn),以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 引物特異性檢測(cè) 以EDL933為模板,加入相應(yīng)單一引物進(jìn)行擴(kuò)增,均可擴(kuò)增出相應(yīng)目標(biāo)條帶,而陰性對(duì)照MG1655及空白對(duì)照未見擴(kuò)增(圖1)。

2.2 O157∶H7菌株檢出情況 經(jīng)O157(rfbEO157)及H7(f liCH7)抗原特異基因檢測(cè)末明,我國1992-2006年收集的345株O157、H7抗原陽性的菌株rf bEO157及f liCH7特異基因均為陽性。

2.3 O157∶H7菌株的毒力基因檢測(cè) 對(duì)收集的O157∶H7菌株四種毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示,st x2基因的陽性率為91.9%,但只有少數(shù)菌株(13.3%)攜帶st x1基因。攜帶有stx1基因的菌株同時(shí)也攜帶有st x2基因的占97.9%,且只分布在1992年(4株)、1999年(15株)、2001年(19株)、2002年(6株)及2005年(1株)分離的菌株中。eaeA和hly A基因的陽性率分別為99.4%和99.1%。檢測(cè)菌株中毒力基因型以eaeA+hlyA+stx2為主(見表2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),stx2陽性的317株菌中,eaeA均為陽性,hly A基因陰性的菌株只有2株;而stx1或stx2陰性的27株菌中,eaeA均為陽性,hlyA陽性的為26株。

2.4 菌株來源及毒力基因分析 本研究中的345株菌中,來源于人的菌株25株中,stx1的陽性率為32.0%,stx2陽性率為92.0%。其余大多數(shù)來源于動(dòng)物宿主。來源于羊的菌株中92.6%攜帶st x2基因,僅有1.4%攜帶stx1基因,來源于牛、豬、雞的菌株st x2、stx1基因陽性率分別為91.7%、10.0%,87.2%、6.4%,88.2%、8.8%(圖 2)。人及不同動(dòng)物之間st x2基因的攜帶率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.980,P=0.739)。

3 討 論

1999年我國江蘇省徐州市及鄰近的安徽省發(fā)生了一次大腸埃希菌O157∶H7感染暴發(fā),導(dǎo)致177人死亡。2000年在河南省又發(fā)生了一次暴發(fā),導(dǎo)致

28人死亡〔7〕。本次實(shí)驗(yàn)中的菌株主要分離自1999-2000年。近年來雖然沒有出現(xiàn)大的O157∶H7感染暴發(fā),但從中國疾病預(yù)防控制中心2006-2008年的傳染病監(jiān)測(cè)報(bào)告看,每年均能從人或動(dòng)物中分離出產(chǎn)毒性大腸埃希菌O157∶H7菌株。我們對(duì)345株大腸埃希菌O157∶H7的特異基因檢測(cè)表明,O157及H7抗原陽性的菌株rfbEO157及f liCH7特異基因均為陽性。因此在實(shí)際篩查工作中,可以通過簡(jiǎn)單快速的基因檢測(cè),來取代繁瑣耗時(shí)的血清學(xué)試驗(yàn)。

表1 PCR引物序列、反應(yīng)條件及擴(kuò)增片段大小Table 1 The sequence of primers for the PCR,annealing temperature and the sizes amplified

表2 345株O157∶H7菌株來源及毒力基因檢測(cè)結(jié)果Table 2 The virulent genes profiles of 345 O157∶H7 isolates

大腸埃希菌O157∶H7可攜帶不同型別的stx基因,stx基因的存在及具有活性的Stx是影響疾病發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的重要因素,Stx2能引起更加嚴(yán)重的癥狀和組織病理學(xué)改變,與嚴(yán)重疾病的關(guān)系較Stx1更為密切〔7-8〕。對(duì)345株菌株的毒力基因檢測(cè)表明我國O157∶H7菌株主要為eaeA+hly A+stx2毒力基因型,而stx1單獨(dú)陽性的菌株只有1株。從2006-2008年中國疾病預(yù)防控制中心的監(jiān)測(cè)報(bào)告看,近年分離的產(chǎn)毒性O(shè)157∶H7菌株也只有st x2基因陽性,而沒有stx1陽性的菌株。部分人和動(dòng)物來源的菌株只檢測(cè)到eaeA和hlyA毒力基因,而stx1或stx2基因均陰性,這類菌株在致病性和流行病學(xué)方面的意義尚不清楚。

毒力基因的存在是病原菌導(dǎo)致機(jī)體感染的重要條件。對(duì)動(dòng)物來源的大腸埃希菌O157∶H7毒力基因分析表明,攜帶毒力基因的菌株廣泛存在于羊、牛等動(dòng)物宿主中。中國大腸埃希菌O157∶H7的感染多發(fā)在農(nóng)村,由于農(nóng)村地區(qū)羊、牛等家畜家禽常見且多為散養(yǎng),認(rèn)為羊、牛等家畜家禽是大腸埃希菌O157∶H7感染的重要傳染源,動(dòng)物宿主在大腸埃希菌O157∶H7感染的暴發(fā)流行中具有重要作用。因此,掌握動(dòng)物宿主的帶菌情況在預(yù)防和控制大腸埃希菌 O157∶H7感染流行的工作中具有重要意義。

〔1〕Paton JC and Pton AW.Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producingEscherichia coliinfections〔J〕.Clin Microbiol Rev,1998,11(3)：450-479.

〔2〕Paton AW and Paton JC.Detection and characterization of Shiga toxigenicEscherichia coliby using multiplex PCR assays forstx1,stx2,eaeA,EnterohemorrhagicE.coli hlyA,r fbO111,andrfbO157〔J〕.J Clin Microbiol,1998,36(2)：598-602.

〔3〕Johnson JR,Stell A.PCR for specific detection of H7 flagellar variant off liCamong ex traintestinal pathogenicEscherichia coli〔J〕.J Clin Microbiol,2001,39(10)：3712-3717.

〔4〕Zhang W,Bielaszewska M,Kuczius T,et al.Identification,chateracterization,and distribution of a Shiga toxin 1 gene variant(stx1c)inEscherichia colistrains isolated from humans〔J〕.J Clin Microbiol,2002,40(4)：1441-1446.

〔5〕Schmidt H,Montag M,Bockemuhl J,et al.Shiga-like toxin II-related cytotoxins inCitrobacter freundiistrains from humans and beef samples〔J〕.Infect Immun,1993,61(2)：534-543.

〔6〕Wang G,Clark CG,Rodgers FG.Detection inEscherichia coliof the genes encoding the major virulence factors,the genes defining the O157∶H7 serotype,and components of the ty pe 2 Shiga toxin family by multiplex PCR〔J〕.J Clin Microbiol,2002,40(10)：3613-3619.

〔7〕Zheng H,Jing H,Wang H,et al.st x2vhais the dominant genotype of Shiga toxin-producingEscherichia coliO157∶H7 isolated from patients and domestic animals in three regions of China〔J〕.Microbio Immunol,2005,49(12)：1019-1025.

〔8〕羅霞,葉長蕓,李芳,等.大腸埃希菌O157∶H7攜帶stx2：：IS1203v基因研究〔J〕.中華流行病學(xué)雜志,2007,28(11)：1119-1122.