貝氏柯克斯體重組膜蛋白抗原激活樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答*

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)廣泛分布于腦以外的全身組織和臟器,數(shù)量較少,是人體內(nèi)功能最強(qiáng)也是唯一能活化靜息T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞;有不成熟(immature dendritic cells,iDCs)和成熟(mature dendritic cells,mDCs)兩個(gè)分化階段。iDCs擔(dān)負(fù)免疫哨兵的職責(zé),密切監(jiān)控病原的入侵,在感染部位吞噬和處理病原并在病原抗原的刺激下轉(zhuǎn)變?yōu)閙DCs〔1〕;mDCs在起始免疫中發(fā)揮抗原呈遞功能,是機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的始動(dòng)者。當(dāng)iDCs受到外源刺激后會(huì)向淋巴結(jié)遷移,在此過程中伴隨著它功能和表型的成熟,主要體現(xiàn)在細(xì)胞表面分子如共刺激分子 CD80、CD40、CD58、CD86 以及成熟標(biāo)記分子CD83的表達(dá)增加和細(xì)胞因子分泌的改變〔2〕。

貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii,Cb)為Q熱的病原體,專性吞噬細(xì)胞內(nèi)寄生,對人和動(dòng)物的感染性極強(qiáng),為重要的人獸共患病原體〔3〕。本實(shí)驗(yàn)以人源DCs的體外培養(yǎng)體系為模型,用5種Cb重組膜蛋白分別對體外培養(yǎng)的DCs刺激,比較這5種膜蛋白促DCs成熟能力,并用其中促成熟作用最強(qiáng)的SecB蛋白間接刺激T細(xì)胞,探討其誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答能力。

1 材料與方法

1.1 試劑 細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640、胎牛血清購于 Hyclone公司,細(xì)胞誘導(dǎo)因子 rhGM-CSF、rhIL-4購于PEPROTECH INC.公司,Ni-NTA Agarose試劑盒購于QIAGEN,藍(lán)菌 素 BFA、鼠 抗 人 CD11c、CD83、CD80、CD40、CD86、CD58、CD54、CD3、CD4、CD8、CD69、IFN-α、IL-12p70、IL-10、IFN-γ、TNF-α、均購于BD公司,淋巴細(xì)胞分離液、大腸桿菌LPS、PHA購于Sigma公司,鱟試劑購于北京百星高科技公司。

1.2 重組蛋白 含有CbicmO、enhA、secB、lo1A、htpB基因的重組菌由本室構(gòu)建〔6〕;培養(yǎng)重組菌并誘導(dǎo)目的蛋白IcmO、EnhA、SecB、Lo1A、HspB表達(dá),集菌后進(jìn)行蛋白純化。蛋白純化過程依據(jù)Ni-NTA Agarose試劑盒說明書,概述如下：(1)可溶性表達(dá)形式的目的蛋白 IcmO、SecB、HspB的純化：超聲裂解表達(dá)目的蛋白的重組菌后,離心收集裂解上清,與Ni-NTA振蕩混勻,倒入純化空柱中,洗滌后,加入洗脫緩沖液,收集洗脫蛋白。(2)包涵體表達(dá)形式的目的蛋白EnhA與Lo1A的純化：超聲裂解表達(dá)目的蛋白的重組菌后,離心棄上清,加入變性緩沖液B變性蛋白,再次離心收集上清,與Ni-NTA振蕩混勻,靜置后洗滌混合物2～3次,依次加入含6mol/L至0M尿素的復(fù)性緩沖液,復(fù)性完成后棄上清,后續(xù)步驟同可溶性表達(dá)形式的目的蛋白的純化。純化的蛋白加入TritonX-114去除 LPS,鱟試劑檢測 LPS濃度均低于0.005EU/mL。

1.3 樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞 從解放軍307醫(yī)院輸血科獲得健康人新鮮濃縮白細(xì)胞,直接用淋巴細(xì)胞分離液從濃縮白細(xì)胞中分離出單個(gè)核細(xì)胞,用含10%小牛血清的RPMI-1640懸浮后按1×106細(xì)胞/mL密度鋪于12孔板,置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中,貼壁2～5h,分別收集懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞。懸浮細(xì)胞主要是T細(xì)胞,將其凍存,待用時(shí)取出。貼壁細(xì)胞大部分是單核細(xì)胞,含有少量B淋巴細(xì)胞。加入培養(yǎng)液RPMI-1640(含10%小牛血清、103U/mL rhGM-CSF、103U/mL rhIL-4)培養(yǎng)分離出單核細(xì)胞,將細(xì)胞懸液加到12孔板內(nèi)培養(yǎng),每孔 1mL;將細(xì)胞置 37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d,隔天加入103U/mL rhGM-CSF和103U/mL rhIL-4對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),每3d半量換液1次。

1.4 刺激樹突狀細(xì)胞 分別用純化的5種蛋白以及大腸桿菌LPS刺激體外培養(yǎng)的DCs,將加入蛋白洗脫液刺激的DCs作為模擬刺激組。其中重組蛋白以20μ g/mL的終濃度刺激DCs,大腸桿菌LPS以6μ g/mL的終濃度刺激DCs。加入刺激物24h后,收集各組細(xì)胞做細(xì)胞表型分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng) 將接受SecB蛋白刺激的DCs或其培養(yǎng)上清作為刺激物,將復(fù)蘇的凍存的同種同體T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,進(jìn)行共培養(yǎng),其中調(diào)節(jié)DCs密度為104/mL,T細(xì)胞密度為106/mL,DCs與T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)比例為1∶100,DCs培養(yǎng)上清按100μ L/mL加入。培養(yǎng)12或24h,收獲細(xì)胞。其中與未受刺激DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞作為陰性對照組,與受細(xì)胞洗脫液刺激的DCs共培養(yǎng)的 T細(xì)胞作為模擬刺激組,以 PHA(10μ g/mL)刺激的 T細(xì)胞作為陽性對照組。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型 收集各組細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液,PBS洗滌細(xì)胞2次,500g離心5min,棄上清,調(diào)整細(xì)胞密度為2×1010個(gè)/L,以每測試管50μ L的體積分裝,再分別用 CD11c-APC、CD58-FITC、CD80-PE、CD40-FITC、CD83-PE、CD54-PE、CD86-PE熒光抗體對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,置于4℃,避光反應(yīng) 30min,PBS洗細(xì)胞 2次,500g離心 5min,去除上清后每測試管加入500μ L含有1%多聚甲醛的PBS懸浮固定,用FACS-Calibur flow cytometer(Becton Dickinson)流式細(xì)胞儀對處理標(biāo)本進(jìn)行檢測,通過CELLQUEST軟件分析細(xì)胞表面分子的表達(dá)。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá) 誘導(dǎo)培養(yǎng)5d的DCs接受刺激物刺激20h,加入 BFA繼續(xù)培養(yǎng)4h,細(xì)胞因子的分泌被阻斷在高爾基體,收集細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,用含1%BSA的PBS洗滌細(xì)胞2次,500g離心5min,棄上清,調(diào)整細(xì)胞密度為2×1010個(gè)/L,CD11c-APC標(biāo)記細(xì)胞膜分子,室溫避光 30min,加入 1mL溶血素,避光,室溫放置10min,離心去上清,加入0.5mL破膜劑,再次室溫避光放置10min;離心,用含 1%BSA 的PBS洗滌細(xì)胞2,加入 IFN-α-PE、IL-12p70-PE、IL-10-PE對胞內(nèi)相應(yīng)抗原進(jìn)行標(biāo)記,室溫避光30min,含1%BSA的PBS洗滌細(xì)胞2次,去除上清后加入500μ L PBS重懸細(xì)胞,用 FACS-Calibur flow cytometer流式細(xì)胞儀對處理標(biāo)本進(jìn)行檢測,通過CELLQUEST軟件分析細(xì)胞因子的表達(dá)。T細(xì)胞接受相應(yīng)刺激20h,加入BFA繼續(xù)培養(yǎng)4h,收集細(xì)胞,抗體標(biāo)記步驟同上,所選擇的抗體依次是細(xì)胞膜分子抗體 CD3-PerCP、CD4-APC、CD8-APC,胞內(nèi)抗體 IFN-γ-FITC、TNF-α-PE、IL-10-PE。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞活化 接受相應(yīng)刺激的T細(xì)胞培養(yǎng)12h,收集細(xì)胞,對細(xì)胞表面分子進(jìn)行標(biāo)記,熒光抗體依次 是 CD3-PerCP、CD4-APC、CD8-APC 及 CD69-PE,用FACS-Calibur flow cytometer流式細(xì)胞儀對處理標(biāo)本進(jìn)行檢測,通過CELLQUEST軟件分析細(xì)胞表面分子的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析方法 各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)用SAS9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素k水平定量資料的方差分析〔4〕。

2 結(jié) 果

2.1 5種重組蛋白對DCs促成熟作用比較 5種重組蛋白分別刺激體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的DCs,刺激24h,以DCs成熟標(biāo)記分子CD83以及共刺激分子CD54 、CD58、CD80、CD86、CD40的表達(dá)來比較 5 種蛋白對DCs促成熟作用的強(qiáng)弱。結(jié)果顯示SecB的促成熟作用最強(qiáng),在該蛋白刺激下DCs表面CD40的表達(dá)水平超過陽性對照組大腸桿菌LPS的刺激,CD83 、CD54、CD58、CD80、CD86的表達(dá)水平與大腸桿菌LPS的刺激不相上下;蛋白 IcmO、EnhA對DCs刺激作用相當(dāng),除CD83與CD40的表達(dá)水平較低外,其余幾種表面分子的表達(dá)均得到上調(diào);Lo1A蛋白作用較弱,而促成熟作用最弱的是HspB蛋白,CD83、CD40、CD58、CD80的表達(dá)依然維持在基礎(chǔ)狀態(tài),見圖1。

2.2 SecB蛋白刺激DCs的細(xì)胞因子檢測 上述結(jié)果表明SecB蛋白的刺激能夠有效地促進(jìn)DCs表型的成熟,那么成熟的DCs能夠分泌何種類型的細(xì)胞因子?我們用藍(lán)菌素BFA阻斷細(xì)胞因子向胞外的分泌,將其截留在細(xì)胞內(nèi),流式檢測證明由SecB刺激成熟的DCs胞內(nèi)產(chǎn)生I型細(xì)胞因子IL-12,見圖2。結(jié)果同時(shí)也發(fā)現(xiàn)IL-10的產(chǎn)生,但與IL-12相比,顯得微乎其微。多次實(shí)驗(yàn)均未檢測出IFN-α的分泌。

2.3 SecB激活DCs對 T細(xì)胞早期活化分析CD69是T淋巴細(xì)胞激活后最早表達(dá)的表面抗原,當(dāng)其表達(dá)后,可作為共刺激信號(hào)促進(jìn)T細(xì)胞進(jìn)一步活化和增殖〔5-6〕。檢測SecB蛋白激活 DCs(SecBDCs)或激活DCs培養(yǎng)上清(SecB-DC-S)刺激的同種同體T細(xì)胞,結(jié)果顯示SecB-DC或SecB-DC-S活化CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的CD69的表達(dá)均高于以PHA刺激陽性對照組,見圖3、4;SecB-DC-S活化T細(xì)胞的CD69水平為SecB-DCs活化T細(xì)胞的1.4-1.7倍。

2.4 SecB激活DCs誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子我們將SecB-DCs和SecB-DC-S分別與同種同體的T細(xì)胞共培養(yǎng)24h,然后分別檢測CD4+和CD8+T細(xì)胞內(nèi)的IFN-γ、TNF-α以及IL-10表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不管是SecB-DCs還是SecB-DC-S刺激,在CD4+和CD8+T細(xì)胞內(nèi)均檢測到Th1和Tc1特征性細(xì)胞因子IFN-γ,同時(shí)也檢測到 TNF-α(圖5、6),但均未檢測出IL-10。SecB-DC-S誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和 TNF-α能力強(qiáng)于SecB-DCs(圖5A 、B);其中SecB-DC-S誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)量是CD4+T細(xì)胞的1.2倍(圖 5B),而 SecB-DC-S誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞TNF-α的表達(dá)量是CD8+T細(xì)胞表達(dá)量的3倍(圖6B);SecB-DCs誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力不分上下(圖5A),但誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞分泌TNF-α的能力僅為CD4+T細(xì)胞的25%(圖6A)。

3 討 論

Cb icmO、enhA、secB、lo1A、htpB基因分別編碼Ⅳ分泌系統(tǒng)蛋白IcmO、增強(qiáng)入侵蛋白EnhA、蛋白輸出蛋白SecB、外膜脂質(zhì)載體蛋白Lo1A、熱休克蛋白HspB,這5種蛋白在Cb的感染中擔(dān)負(fù)不同的功能。本研究用這5種蛋白分別刺激人源DCs,結(jié)果表明它們對DCs的表型促成熟作用存在較大差異。SecB蛋白的促DCs成熟能力最強(qiáng),能夠促進(jìn)DCs表型完全成熟;而HspB則表現(xiàn)出很弱的刺激能力,僅有限地提高了CD54和CD86的表達(dá)。多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明DCs受到HspB刺激后表面共刺激分子表達(dá)維持在較低水平,而成熟標(biāo)記分子CD83的表達(dá)水平僅與iDCs相似,提示HspB不能誘導(dǎo)DCs成熟。有研究認(rèn)為只有成熟DCs才能在起始免疫中發(fā)揮抗原呈遞功能;一旦DCs的成熟環(huán)節(jié)被阻斷或是改變,導(dǎo)致不成熟或不完全成熟DCs的形成,DCs的免疫功能也隨之發(fā)生變化,參與抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)、引發(fā)的機(jī)體免疫耐受。已有研究證實(shí)貝氏柯克斯體強(qiáng)毒株感染DCs能干擾DCs的成熟,達(dá)到逃避免疫監(jiān)控的目的〔7〕,但貝氏柯克斯體弱毒株不具備此功能,具體機(jī)制目前并不十分清楚。我們以前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)Cb新橋株LPS與滅活新橋株刺激DCs后導(dǎo)致其表型更接近未成熟DCs,而去掉LPS新橋株全菌蛋白的刺激雖然能提高DCs的成熟度但與完全成熟的DCs膜分子的表達(dá)水平依然有一定差距〔8〕,這些結(jié)果提示了除了貝氏柯克斯體LPS外還有其它蛋白參與 DCs活化的抑制作用。

圖5 抗原刺激 DCs誘導(dǎo)T細(xì)胞IFN-γ表達(dá)A：抗原刺激DCs誘導(dǎo);B：抗原刺激DCs的培養(yǎng)上清誘導(dǎo)。*與模擬刺激DCs誘導(dǎo)比較,P＜0.05Fig.5 IFN-γ expression of T cells induced by antigenpulsed DCsA,Induced by antigen-pulsed DCs;B,Induced by culture supernatant of antigen-pulsed DCs.*Compared by that induced by mock-stimulated DCs,P＜0.05.

圖6 抗原刺激DCs誘導(dǎo)T細(xì)胞TNF-α表達(dá)A：抗原刺激DCs誘導(dǎo);B：抗原刺激DCs的培養(yǎng)上清誘導(dǎo)。*與模擬刺激DCs誘導(dǎo)比較,P＜0.05Fig.6 TNF-α expression of T cells induced by antigenpulsed DCsA,Induced by antigen-pulsed DCs;B,Induced by culture supernatant of antigen-pulsed DCs.*Compared with that induced with mock-stimulated DCs,P＜0.05.

DCs作為體內(nèi)唯一能活化初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞,在提呈抗原之前以未成熟的狀態(tài)遍布全身各組織器官,一旦iDCs捕獲抗原,iDCs可迅速分化為mDCs,細(xì)胞表型發(fā)生改變,表現(xiàn)為細(xì)胞膜上MHC II類分子表達(dá)上調(diào),淋巴功能相關(guān)抗原CD58、細(xì)胞間黏附分子CD54、信號(hào)分子CD40、共刺激分子CD80和CD86等T細(xì)胞活化輔助分子表達(dá)明顯增加,并出現(xiàn) DCs成熟標(biāo)志 CD83〔2〕。mDCs能抵抗 IL-10的抑制作用,分泌高水平的 IL-12。DCs的成熟對于啟動(dòng) T細(xì)胞免疫至關(guān)重要。在DCs活化T細(xì)胞的過程中,DCs將通過表面分子的表達(dá)與T細(xì)胞建立活化信號(hào)傳導(dǎo)通路：CD58與 T細(xì)胞CD2分子相互黏附促進(jìn)T細(xì)胞識(shí)別抗原的功能;CD80、CD86與 T細(xì)胞CD28結(jié)合為 T細(xì)胞TCR/CD3活化途徑提供重要的協(xié)同刺激信號(hào);CD40的表達(dá)誘導(dǎo)了 T細(xì)胞CD40L(CD154)的表達(dá),而CD40L的表達(dá)又進(jìn)一步刺激DCs上調(diào)共刺激分子的表達(dá)與 IL-12的分泌,這樣不僅延長了DCs的存活時(shí)間,又活化了T細(xì)胞,并促使T細(xì)胞向Th1應(yīng)答方向發(fā)展〔9〕。

SecB蛋白的刺激使DCs表面成熟標(biāo)記分子CD83以及多種T細(xì)胞活化輔助分子、共刺激分子處于高表達(dá)狀態(tài),其表達(dá)水平和E.coliLPS的刺激不相上下。這一結(jié)果證明SecB蛋白能夠誘導(dǎo)人源DCs表型的成熟,使其具備啟動(dòng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的條件。mDCs在行使抗原呈遞功能的同時(shí),通過自身表面多種分子活化 T細(xì)胞。作為體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,DCs本身還分泌不同的細(xì)胞因子參與先天性和獲得性免疫應(yīng)答。因此,本研究進(jìn)一步對DCs分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測,證實(shí)SecB在誘導(dǎo)DCs表型成熟的同時(shí)也促進(jìn)了以IL-12為主的細(xì)胞因子的表達(dá),提示此時(shí)DCs的功能已被激活,具備刺激T細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化、啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能。

我們以T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69為檢測對象,證明了被SecB刺激成熟的DCs與其培養(yǎng)上清均能活化T細(xì)胞,兩者刺激T細(xì)胞表達(dá)CD69的程度高于陽性對照PHA的刺激。同時(shí),DCs培養(yǎng)上清激活T細(xì)胞的能力顯著強(qiáng)于DCs,說明T細(xì)胞的活化與SecB激活DCs分泌的細(xì)胞因子密切相關(guān)。研究已證明成熟的DCs通過表面粘附分子、MHC/抗原肽段與T細(xì)胞相互作用提供自身活化增殖分化的第一信號(hào);通過兩者間共刺激因子的相互作用提供自身增殖與分化的第二信號(hào),活化T細(xì)胞使其分泌 IL-12、IL-4、IL-6、IFN-γ等細(xì)胞因子,進(jìn)一步誘發(fā)自身的增殖與分化;而DCs所分泌的細(xì)胞因子(IL-12)則提供了第三信號(hào),是活化 T細(xì)胞的增殖與分化必不可少的因素〔10〕。我們已經(jīng)證明DCs在SecB的刺激下產(chǎn)生以IL-12為主的細(xì)胞因子,它的分泌使DCs培養(yǎng)上清具有活化T細(xì)胞的功能,其作用強(qiáng)于DCs與T細(xì)胞的直接相互作用。mDCs不僅能活化T細(xì)胞,更重要的是它們能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化方向,參與T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示DCs受到SecB刺激后,誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)了Th1與Tc1特征性細(xì)胞因子IFN-γ,也表達(dá)了對T細(xì)胞增殖、對巨噬細(xì)胞殺菌活性有促進(jìn)作用的炎性細(xì)胞因子TNF-α。一些研究證明在Cb的感染中IFN-γ和TNF-α有利于機(jī)體啟動(dòng)保護(hù)性免疫反應(yīng),控制Cb在細(xì)胞內(nèi)的繁殖〔11-13〕。因而 IFN-γ和TNF-α的表達(dá)表明SecB激活DCs誘發(fā)了T細(xì)胞向Th1與T c1的分化,引發(fā)了特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,有利于吞噬細(xì)胞內(nèi)Cb的清除。我們的研究提示SecB是貝氏柯克斯體潛在保護(hù)性抗原,可能誘導(dǎo)機(jī)體抗貝氏柯克斯體免疫應(yīng)答。

〔1〕Steinman RM,Banchereau J.Taking dendritic cells into medicine〔J〕.Nature,2007,449(7161)：419-426.

〔2〕Banchereau J,Steinman RM.Dendritic cells and the control of immunity〔J〕.Nature,1998,392(6673)：245-252.

〔3〕Marrie T J.Q fever pneumonia〔J〕 .Curr Opin Infect Dis,2004,17(2)：137-142.

〔4〕胡良平.口腔醫(yī)學(xué)科研設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析〔M〕.北京：人民軍醫(yī)出版社,2007：215-220.

〔5〕Bikah G.Pouge-Caley RR,McHeyzer-Williams LJ,et al.Regulating T helper cell immunity through antigen responsiveness and calcium entry〔J〕.Nat Immunol,2000,1(5)：402-412.

〔6〕Sancho D,Santis AG,Alonso-Lebrero JL,et al.Functional analysis of ligand-binding and signal transduction domains of CD69 and CD23 C-ty pe lectin leukocyte receptors〔J〕.J Immunol,2000,165(7)：3868-3875.

〔7〕Shannon JG,Howe D,Heinzen RA.VirulentCox iella burnetiidoes not activate human dendritic cells：role of lipopolysaccharide as a shielding molecule〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(24)：8722-8727.

〔8〕王穎,吳德平,王錫樂,等.貝氏柯克斯體新橋株刺激人樹突狀細(xì)胞的表型分析〔J〕.中國人獸共患病雜志,2009,25(11)：1041-1045.

〔9〕Aimanianda V,Haensler J,Lacroix-Desmazes S,et al.Novel cellular and molecular mechanisms of induction of immune responses by aluminum adjuvants〔J〕.Trends Pharm Sci,2009,30：287-295.

〔10〕金伯泉.細(xì)胞和分子免疫學(xué)〔M〕.北京：科學(xué)出版社,2001：495-502.

〔11〕Honstettre A,Ghig o E,Moynault A,et al.Lipopolysaccharide fromCoxiella burnetiiis involved in bacterial phagocytosis,filamentous actin reorganization,and inflammatory responses through T oll-like receptor 4〔J〕.J Immunol,2004,172(6)：3695-3703.

〔12〕Shannon JG,Heinzen RA.Adaptive immunity to the obligate intracellular pathogenCoxiella burnetii〔J〕.Immunol Res,2009,43：138-148.

〔13〕Ghigo E,Honstettre A,Capo C,et al.Link between impaired maturation of phagosomes and defectiveCoxiellaburnetiikilling in patients with chronic Q fever〔J〕.J Infect Dis,2004,190：1767-1772.