陳韶紅,張永年,李樹清,艾 琳,陳家旭

2.上海出入境檢驗檢疫局

近年來,隨著社會的發展,人們的膳食結構及烹飪方式也在逐步發生變化,特別是生食和半生食方式的引入和推廣,鮮活魚類(包括蟹、螺、蛙、龜、魚)等水產品的攝入量較以往大大增加,使得食源性寄生蟲的人體感染率猛增。水產品中華支睪吸蟲和并殖吸蟲的感染度在許多地區呈上升趨勢,并殖吸蟲病和華支睪吸蟲病在一些大中城市屢見暴發,水產品中寄生蟲囊蚴的檢測已經成為食品安全的首要問題。傳統檢測水產品中寄生蟲囊蚴的方法是用消化法解剖鏡下檢查吸蟲囊蚴〔1〕,但需要檢測人員具有豐富的鏡檢經驗,且有操作時間長、易漏檢的缺點,本研究在傳統鏡檢的基礎上,建立了FTA法檢測水產品中吸蟲囊蚴的定量PCR技術,為相關的監督執法、行政的監督監測等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 水產品樣本 含華支睪吸蟲囊蚴的麥穗魚(采自廣西省北海市);含并殖吸蟲囊蚴的溪蟹(采自浙江省永嘉縣)、含東方次睪吸蟲囊蚴的淡水魚(采自廣西省北海市)。

1.2 主要儀器 PCR儀(美國ThermoPX2),凝膠分析成像系統(Bio-RAD公司Quantity on 4.6.6),低溫離心機(美國Thermo公司);直徑6mm打孔機(Whatman公司)

1.3 主要試劑

1.3.1 FTA卡(Whatman公司)

1.3.2 FTA卡洗液T E buffer(0.01 mol/L T ris-HCl,pH 8.0 0.1 mmol/L EDTA)(Whatman公司)

1.3.3 2×Taq PCR Master Mix(0.1U Taq Polymerase/L 、500 μ mol/L dNTP 、20mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、100mmol/L KCl、3mmol/L MgCL2 、其它穩定劑和增強劑)-由上海生工生物制品有限公司。

1.3.4 TAE電泳緩沖液(儲備液 50×)：Tris堿242g、冰醋酸 57.1mL、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)100 mL,用蒸餾水定容至1000 mL,混勻,室溫保存。使用時取2 mL 50×TAE電泳緩沖液,稀釋為200 mL工作液(0.5×)即可。

1.3.5 溴化乙錠、瓊脂糖、0.1 mmol/L EDTA(pH 8.0)、10 mmol/L T ris-HCl、2%胃蛋白酶 。

1.3.6 Wizard SV Genomic DNA Purification System Promega試劑盒。

1.4 引物合成

1.4.1 華支睪吸蟲囊蚴引物合成：引物由上海生工生物技術公司合成(見表1)。

1.4.2 并殖吸蟲囊蚴引物合成 由上海生工生物技術公司合成(見表2)。

1.4.3 東方次睪吸蟲囊蚴引物合成：由上海生工生物技術公司合成(見表3)。

表1 華支睪吸蟲囊蚴引物合成序列

表2 并殖吸蟲囊蚴引物合成序列

表3 東方次睪吸蟲囊蚴引物合成序列

1.5 方法

1.5.1 華支睪吸蟲囊蚴的檢測

1.5.1.1 消化法鏡檢 稱取魚肉300g,搗碎,按1∶5比例加入2%人工胃蛋白酶消化液,37℃消化過夜,用尖底量筒沉淀,取沉渣用解剖鏡鏡檢分離囊蚴。

1.5.1.2 FTA 定量PCR法 ：將1個 、3個、5個 、10個華支睪吸蟲囊蚴,分別加入含1g魚肉的試管中,每管分別加入pH 8.0緩沖液用細玻璃珠勻漿打碎,分別吸取勻漿液 20μ L滴在 FTA 卡上,自然干燥(或56℃5min)直接提取DNA,用打孔機打孔制的一張直徑6mm的濾膜片,用FTA卡洗液洗3次,每次5min,涼干后剪碎濾紙片于 PCR反應管中,以提取的DNA為模板進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物是否有特征條帶。

PCR擴增：總體積為 100μ L。反應體系為DNA模板剪碎(制好的直徑6mmFTA濾膜片一片),2×Taq PCR Master Mix 50μ L;1%BSA 4μ L;10 μ mol/L 引物各 3μ L;ddH2O40μ L 。

反應條件：94℃預變性3 min;94℃變性1min,62℃退火1min,72℃延伸1min,40個循環;72℃延伸10 min。擴增產物長度分別為315bp。

1.5.2 并殖吸蟲囊蚴的檢測

1.5.2.1 搗碎法鏡檢 收集陽性溪蟹(或喇蛄)1只,用竹筒和竹棒研磨溪蟹(或喇蛄),用100目銅篩過濾去除蟹殼后置1 000mL尖底量筒沉淀20min,沉淀物解剖鏡鏡檢分離囊蚴。

1.5.2.2 FTA定量PCR法 將分離的囊蚴分別計數,分為1個、3個、5個,分別加入含1g蟹肉的試管中,每管分別加入pH 8.0緩沖液用細玻璃珠勻漿打碎,分別吸取勻漿液20μ L滴在FTA卡上,自然干燥(或56℃5min)直接提取DNA,用打孔機打孔制的一張直徑6mm的濾膜片,用FTA卡洗液洗3次,每次5min,涼干后剪碎濾紙片于PCR反應管中,以提取的DNA為模板進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物是否有特征條帶。

PCR擴增：總體積為 100μ L。反應體系為DNA模板剪碎(制好的直徑6mmFTA濾膜片一片),2×Taq PCR Master Mix 50μ L;1%BSA 4μ L;10 μ mol/L 引物各 3μ L;ddH2O 40μ L 。

反應條件：95℃預變性1 min;94℃變性50s,68℃退火2min,68℃延伸5 min,35個循環;68℃延伸7 min。擴增產物長度為560bp。

1.5.3 東方次睪吸蟲囊蚴的檢測

1.5.3.1 消化法鏡檢 稱取魚肉300g,搗碎,按1∶5比例加入2%人工胃蛋白酶消化液,37℃消化過夜,用尖底量筒沉淀,取沉渣用解剖鏡鏡檢分離。

1.5.3.2 FTA定量PCR法：將分離的囊蚴分別計數,分為1個、3個、5個,分別加入含1g魚肉的試管中,每管分別加入pH 8.0緩沖液用細玻璃珠勻漿打碎,分別吸取勻漿液20μ L滴在FTA卡上,自然干燥(或56℃5min)直接提取DNA,用打孔機打孔制的一張直徑6mm的濾膜片,用F TA卡洗液洗3次,每次5min,涼干后剪碎濾紙片于 PCR反應管中,以提取的DNA為模板進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物是否有特征條帶。

PCR擴增：總體積為 100μ L。反應體系為DNA模板剪碎(制好的直徑6mmFTA濾膜片一片),2×Taq PCR Master Mix 50μ L;1%BSA 4μ L;10 μ mol/L 引物各 3μ L;ddH2O 40μ L 。

反應條件：94℃預變性 5 min;94℃變性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min15s,38個循環;72℃延伸5 min。擴增產物長度分別為1 500bp。

2 結 果

2.1 華支睪吸蟲囊蚴FTA定量PCR法 用華支睪吸蟲成蟲作為對照,在1g魚肉中分別加入1個、3個、5個、10個囊蚴,用試劑盒和FTA法提取囊蚴的DNA,檢測華支睪吸蟲囊蚴 ITS2基因 CS1/CS2,經PCR擴增,在315 bp可見明顯的顯帶,兩種方法電泳膠顯帶效果一致。

2.2 并殖吸蟲囊蚴FTA定量PCR法 用并殖吸蟲成蟲作為對照,在1g蟹肉中分別加入1個、3個、5個囊蚴,用試劑盒和FTA法提取囊蚴的DNA,檢測并殖吸蟲囊蚴ITS2基因3S'/A28,經PCR擴增后,在560bp可見明顯的顯帶,兩種方法電泳膠顯帶效果一致。

2.3 東方次睪吸蟲囊蚴FTA定量PCR法 在1g魚肉中分別加入1個、3個、5個東方次睪吸蟲囊蚴,用試劑盒和FTA法提取囊蚴DNA。檢測東方次睪吸蟲囊蚴ITS2基因BD1/BD2,在1 500 bp可見明顯的顯帶,經 PCR后,兩種方法電泳膠顯帶效果一致。

圖1 華支睪吸蟲囊蚴檢測2種方法的比較(試劑盒和FTA法)Fig.1 Comparison of 2 detection methods for the metacercariae of Clonorchissinensis(kit and FTA)

3 討 論

FTA技術包含一種包埋在過濾基質中蛋白質變性劑、螯合劑和自由基捕捉劑的特殊干燥化學試劑混合物。它對人無毒,用FTA技術收集的核酸可以在室溫和高濕度環境下保存多年而不降解。FTA卡的工作原理是樣品中感染性病原體在接觸FTA時裂解失活,病原體中的核酸則被固定下來。通過簡單的一步,從卡上純化洗脫下來DNA就可以應用于下游擴增實驗。FTA技術具有：①節省低溫運輸樣品以及保存樣品的低溫冰箱的成本。②使有機體快速失活,避免了操作過程中樣品污染的風險。③處理樣品、分離得到DNA僅需15～30min,縮短、減少分離步驟(4～16h)。④樣品處理只需一個簡單的洗脫DNA的過程,省去了使用純化試劑盒的花費。⑤樣品需求量最小化(每個樣品采集區12～40μ L)因此,可廣泛的用于病毒、微生物、寄生原蟲等生物DNA的提取。

傳統檢測水產品中寄生蟲囊蚴的方法是,用消化法在解剖鏡下檢查吸蟲囊蚴,但需要檢測人員具有豐富的鏡檢經驗、且有易漏檢的缺點。Blair等〔2〕通過檢測并殖吸蟲的ITS2和CO1基因的研究分析并殖吸蟲的分類地位,錢寶珍等按 Sugiyama〔3-4〕方法提取囊蚴的DNA,應用隨機擴增多態DNA(PCR-RAPD)技術檢測并殖吸蟲囊蚴分析生物種群間的分子標記,Boris等〔5〕用試劑盒提取螺體中尾蚴和魚中華支睪吸蟲囊蚴的DNA進行PCR擴增,都認為核酸技術檢測吸蟲囊蚴具有高度的敏感性和特異性。但是Sugiyama和試劑盒提取DNA方法都有步驟較繁瑣、時間較長的缺點。隨著FTA技術的出現,使得檢測時間大大的縮短。

東方次睪吸蟲常與華支睪吸蟲同時寄生于魚體內,形態學的鑒定需要有豐富的鏡下工作經驗,常可能出現誤判。因此,作者首次將FTA技術應用于水產品中吸蟲囊蚴的檢測,根據華支睪吸蟲囊蚴ITS2基因CS1/CS2、并殖吸蟲囊蚴ITS2基因3S/A28和東方次睪吸蟲囊蚴ITS2基因BD1/BD2,把這3種吸蟲囊蚴通過核酸檢測技術分別鑒定出來,解決了水產品在囊蚴低感染度的情況下,3種不同的吸蟲具有完全不同的條帶顯示位置,達到能檢測到每克樣品中1個囊蚴水平,從而達到快速、準確檢測水產品中囊蚴,適用于食品衛生檢驗檢疫。

〔1〕李朝品.人體寄生蟲學實驗研究技術〔M〕.北京：人民衛生出版社,2007,225-230.

〔2〕Blair D,Agatsuma T,Watanobe T,et al.Geographical genetic structure within the human lung fluke,Paragonimus westermani,detected from DNA sequences〔J〕.Parasitology,1997,115(Pt4)：411-417.

〔3〕Sugiy ama H,Morishima Y,Kameoka Y,et al.Polymerase chain reaction(PCR)-based molecular discrimination betweenParagonimus westermaniandP.miy azakiiat the metacercarial stage〔J〕.M ol Cell Probes,2002,16(3)：231-236.

〔4〕錢寶珍,沈琦.浙江省衛氏并殖吸蟲致病品系 PCR-RAPD分子標記的初步研究〔J〕.中國人獸共患病學報,2006,22(3)：249-252.

〔5〕Müller B,Schmidt J,M ehlhorn H.Sensitive and species-specific detection ofClonorchissinensisby PCR in infected snails and fishes〔J〕.Parasitol Res,2007,100(4)：911-914.