膠體金免疫層析法快速診斷血吸蟲病的研究*

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膠體金免疫技術是一項繼免疫熒光、免疫酶、放射免疫三大標記技術之后發展起來的新標記技術,已被廣泛用于醫學和生物學等諸多領域,如人類免疫缺陷病毒、甲胎蛋白、幽門螺桿菌、布魯氏菌病及華支睪吸蟲等檢測〔1-4〕。目前血吸蟲病免疫學診斷方法主要采用間接血凝試驗(IHA)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA),2種方法均存在操作步驟復雜,檢測速度慢等缺點。為提高血吸蟲病檢測的水平和時效,我們對膠體金免疫技術快速診斷血吸蟲病作進一步研究,現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 膠體金免疫層析法(GICA)診斷試劑 由浙江省醫學科學院研制。將噴有質控線、檢測線的硝酸纖維素膜切成0.4cm×6cm長條,在其上端貼上吸水墊,下端貼上金標墊及樣品吸收墊;置于塑料卡中,加干燥劑密封后室溫保存。

1.1.2 斑點金免疫滲濾法(DIGFA)和間接血凝試(IHA)診斷試劑 由浙江省醫學科學院研制。

1.1.3 病人血清 采用浙江省輸入性血吸蟲病糞檢陽性病人血清和安徽省血吸蟲病糞檢陽性病人血清。

1.1.4 健康人血清 采用非血吸蟲病流行區山西省大同市天鎮縣陸家灣鎮健康人血清。

1.1.5 交叉血清 采用本實驗室保留的肺血吸蟲病人、華支睪吸蟲病人和乙肝病人血清。

1.2 方法

1.2.1 GICA操作 在檢測板加樣孔內加入待檢血清10μ L,待滲入后,加入生理鹽水 100μ L,5min后觀察結果。檢測線和質控線均出現紅色為陽性;檢測線無色,質控線出現紅色為陰性。

1.2.2 DIGFA和 IHA操作 參照浙施曉華等報道〔5-6〕和血吸蟲病防治手冊〔7〕。

1.2.3 敏感性測試 檢測血吸蟲病糞檢陽性病人血清,觀察陽性符合率。

1.2.4 特異性測試 檢測血吸蟲病非流行區健康人血清,觀察陰性符合率。

1.2.5 交叉反應測試 檢測肺血吸蟲病人、華支睪吸蟲病人和乙肝病人血清,觀察交叉反應。

1.2.6 穩定性和重現性試驗 將保存于室溫下的GICA試劑,每隔3個月用同批血清測定1次,連續測定5次(1年)。每次測定病人和健康人血清。觀察試劑的穩定性和重現性試驗。

1.2.7 GICA與DIGFA及IHA比較 檢測病人和健康人血清,比較3種試劑的敏感性和特異性。

1.2.8 試驗原則與統計學方法 樣本檢測按照單盲試驗原則,實驗結果由2人共同判讀。GICA、DIGFA及IHA檢測結果數據應用SPSS軟件進行統計學分析。

2 結 果

2.1 GICA敏感性及特異性的測試 GICA檢測病人血清106份,陽性98份,陽性率92.5%;檢測健康人血清120份,陽性5份,陽性率4.2%;其敏感性和特異性分別達到92.5%和95.8%,youden指數為0.883。

2.2 GICA交叉反應測試 GICA檢測肺吸蟲病人血清10份,陽性3份;檢測華支睪吸蟲病人血清12份,陽性 3份;檢測乙肝病人血清 35份均為陰性。

2.3 重現性試驗和穩定性試驗 將保存于室溫下的GICA試劑,每隔3個月,測試1次,每次檢測病人血清30份和健康人血清30份,先后重復測試5次。結果病人血清29份陽性,1份陰性;健康人血清,均陰性。重復檢測5次結果一致。

2.4 GICA、DIGFA及IHA 3種方法檢測血吸蟲病敏感性、特異性比較見表1。

表1 GICA、DIGFA及IHA檢測血吸蟲病敏感性、特異性比較Table 1 Cooperation of sensitivity and specificity on schistosomiasis with GICA,DIGFA and IHA

經χ2檢驗3種方法檢測血吸蟲病敏感性、特異性結果之間無統計學意義(P＞0.05)。

3 討 論

目前血吸蟲病免疫學診斷主要采用間接血凝試驗(IHA)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法,2種方法存在操作步驟復雜,檢測速度慢等缺點。金標記技術是近年發展起來的新標記技術,國內已有學者對金標記技術用于血吸蟲病診斷進行研究,已有應用斑點金免疫滲濾法(DIGFA)研發了血吸蟲病診斷試劑〔5-6〕;還有對快速膠體金免疫層析法的建立及其對血吸蟲病診斷效果研究〔8〕,均取得了較理想的結果。

本研究對膠體金免疫層析快速診斷血吸蟲病試劑的敏感性、特異性和交叉反應進行了研究。結果顯示GICA試劑敏感性和特異性分別達到92.5%和95.8%,Youden指數為0.883;符合試劑應用要求。GICA試劑未發現與乙肝病人有交叉反應;但發現與肺吸蟲和華支睪吸蟲病人存在較高交叉反應,可能這3種吸蟲之間存在某些共同抗原,有待于進一步研究和改進。

免疫診斷試劑除了要求有較高的敏感性和特異性外,還必須具有良好的穩定性和重現性,穩定性和重現性是診斷試劑質量的又一重要指標,也是試劑保存條件和有效期限的惟一依據。對保存于室溫下的GICA試劑,1年內重復測試5次,結果不變。表明GICA試劑具有很好的重現性和穩定性,室溫保存有效期限至少1年。

GICA與DIGF和IHA 3種方法檢測血吸蟲病人和健康人血清結果比較,3種方法之間無統計學意義(P＞0.05)。IHA是一種傳統血吸蟲病免疫診斷方法,具有較高的敏感性和特異性,但其操作步驟比較復雜,使用器械多,血清用量25μ L,檢測時間性長(1h),需花費較多的人力和物力;DIGFA具有敏感性強,特異性高優點,且操作簡便,血清用量25μ L,檢測速度快(2min),但試劑為液體,保存期限短;膠體金免疫層析法(GICA)同樣具有試劑敏感、特異外,血清用量更少(10μ L),操作更為簡便,試劑為固態,攜帶方便,保存期長等優點,適合于血吸蟲病流行病學調查及現場應用,為血吸蟲病的防治提供一種新的手段。

〔1〕曹錫坤,陶義訓,韓松,等.滴金免疫測定法在檢測血清甲胎蛋白中的應用〔J〕.上海免疫學雜志,1991,11(3)：154-156.

〔2〕沈麗英,干小仙,丁建祖,等.檢測幽門螺桿菌抗體的金標免疫滲濾法的建立與應用〔J〕.浙江實用醫學,1997,2(4)：14-15.

〔3〕王鵬,郭英,石麗媛,等.鼠疫FI單克隆抗體的膠體金標記及斑點滲濾法檢測FI抗原方法的建立〔J〕.中國地方學病雜志,2005,24(5)：479-481.

〔4〕朱明東,洪林娣,等.膠體金免疫層析法快速診斷布魯氏菌病的研究〔J〕.國際流行病學傳染病學雜志,2008,35(3)：158-160.

〔5〕施曉華,湯益,將健敏,等.滴金免疫測定法(DIGFA)檢測血吸蟲抗體的研究〔J〕.中國血吸蟲病防治雜志,1999,11(3)：132-133.

〔6〕沈麗英,干小仙,丁建祖,等.金標免疫滲濾法快速檢測血吸蟲循環抗原的研究〔J〕.中國人獸共患病雜志,2000,16(1)：12-16.

〔7〕中華人民共和國衛生部疾病控制司.血吸蟲病防治手冊〔M〕.3版.上海科學技術出版社,2000：88-90.

〔8〕曾小軍,陳紅根,袁建華,等.快速膠體金免疫層析法的建立及其對血吸蟲病診斷效果〔J〕.中國血吸蟲病防治雜志,2005,17(1)：24-27.