仔豬心肌原代細胞培養及其對口蹄疫病毒敏感性研究*

FMD是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動物的一種急性高度傳染性疫病,被國際獸疫局列為A類動物傳染病之首。在自然狀態下FMDV可經消化道入侵感染,但呼吸道是最主要的 感染途徑,數個感染性病毒顆粒即可引起易感動物發病。動物、人員及運輸工具等均可機械性的散播病毒〔1〕。幼畜感染本病(以仔豬較多見)往往伴有心肌炎,心肌外呈現黃色條紋斑,心外膜有不同水平的出血點,呈現典型的“虎斑心”癥狀〔2〕,死亡率極高。文獻對口蹄疫致幼畜心肌炎,早有描述,但其致病機理未見報道。

口蹄疫病毒對牛舌上皮、犢牛腎、犢牛甲狀腺、仔豬腎、豚鼠腎、倉鼠腎、仔兔腎原代細胞和仔豬腎、敘利亞倉鼠腎傳代細胞系(BHK21)都較敏感可以產生典型的致細胞病變(CPE)〔1〕。雖然口蹄疫病毒可以致仔豬等幼畜的心肌炎,但口蹄疫病毒是否感染心肌細胞還未見報道。

本試驗參考 Simpson〔3〕等人大鼠心肌原代細胞培養方法和國內文獻〔4-7〕,建立仔豬心肌原代細胞培養方法。然后用O型口蹄疫病毒接種心肌原代細胞來研究其對口蹄疫病毒的敏感性。為進一步研究口蹄疫誘發幼畜心肌炎的致病機理提供細胞模型和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康無FMDV感染的1 d長白仔豬購自蘭州種豬場。

1.2 細胞株和病毒 BHK21細胞株,口蹄疫O型乳鼠適應毒MF6(o/China/99)為本實驗室保存。

1.3 主要試劑及儀器設備 CMM 6201心肌專用培養基、DMEM(高糖)、胰蛋白酶和II型膠原酶購自Gibco公司;胎盤藍;5-溴脫氧核苷(5-Bromodeoxyuridine;Brdu)購自Sigma公司,其余試劑均為國產分析純。CO2培養箱購自德國Heraeus公司;倒置光學顯微鏡購自德國Laica公司。

1.4 仔豬心肌原代細胞的培養 將出生后1 d仔豬,用0.1%的新潔爾滅全身消毒后,迅速前腔靜脈放血處死,解剖仔豬,無菌條件下剪取心室組織,用pH7.2的冰PBS液清洗干凈后剔除纖維結締組織,將組織反復剪成1～3 mm的小塊。加入3～4mL 1∶1混合的2 g/L的胰蛋白酶和1 g/L的膠原酶,置37℃水浴中消化10 min后,自然沉淀,用吸管吸取(棄去)上清液(主要為紅細胞、細胞碎屑及死細胞)。再加入3～4 mL的2 g/L胰蛋白酶和1 g/L膠原酶,置37℃水浴中消化15 min后,再混懸10 s,自然沉降。將上清液移入另一支無菌離心管中,并加入2 mL含有15%(10%～20%)小牛血清的培養液(或冷PBS液)以終止消化。如此反復消化3～8次,至組織塊完全消化為止。將各次消化所制成的細胞懸液集中混勻。用200目的不銹鋼過濾篩過濾后收集到離心管,2 000 r/min離心10 min后,用10%胎牛血清的CMM培養液重懸細胞,用計數板計數細胞,以5×105/mL的濃度每瓶(75 mL細胞瓶)加入 10 mL,放入37 ℃、5%CO2培養箱培養。

1.5 心肌細胞形態觀察 常規倒置顯微鏡觀察細胞形態變化、用相差顯微鏡觀察心肌細胞搏動情況。

1.6 細胞成活率的測定 選用胎盤藍染色法進行細胞存活率測定,死亡細胞被染成淡藍色,活細胞拒染呈陰性反應。取細胞懸液,按9∶1加入0.4%臺盼籃溶液混勻,在倒置顯微鏡下,任選10個視野,每次計數100個心肌細胞,計算細胞存活率。

1.7 O型口蹄疫乳鼠毒對仔豬細胞敏感性 口蹄疫O型乳鼠毒MF6(O/China/99)接種鋪滿單層的仔豬原代心肌細胞,設對照一瓶。每瓶(75mL細胞瓶)接種1mL。37℃、5%CO2孵箱中培養感作1 h,加DMEM 維持液9 mL。然后放37℃、5%CO2孵箱中培養觀察。

1.8 心肌原代細胞毒毒價測定 用本室研制的間接紅細胞凝集試驗試劑盒和夾心ELISA試劑盒檢測細胞毒型別。同時將原代細胞病毒液和BHK21細胞病毒液用DMEM細胞培養液按10倍系列稀釋至 10-7,取 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76個稀釋度,用 96孔板,微量法測定細胞毒價,用Reed-Muench法計算 TCID50。

2 結 果

2.1 長白仔豬心臟細胞原代細胞的分離培養及純化結果 用倒置顯微鏡觀察原代心肌細胞,在未貼壁時呈圓形,貼壁后生長逐漸呈三角形(較多)、梭形、多角形,多形性、胞核1～2個、具有1～2清晰的核仁,細胞形態完整,生長迅速,部分單個細胞自行蠕動,當生長成片后可見呈島嶼狀搏動,見圖1、2。

2.2 細胞成活率測定 計數10個視野內共1 000個心肌細胞,44個細胞染色陽性,成活率為95.6%。

2.3 口蹄疫O型乳鼠毒對仔豬心肌原代細胞敏感性試驗 用長白仔豬原代心肌細胞接口蹄疫O型乳鼠毒MF6(O/China/99),并進行傳代 。從第二代起可以觀察到明顯的細胞病變(CPE)且隨著傳代次數的增加病變時間和收毒時間縮短。傳至第6代收毒時間在20 h左右,14 h出現典型的致細胞病變(CPE),見圖3～4。由此可見,本試驗所培養的仔豬心肌原代細胞可以作為研究口蹄疫致仔豬心肌炎的細胞模型。

2.4 原代細胞毒型別和TCID50結果 用間接紅細胞凝集試驗和夾心ELISA試驗對上述傳代細胞毒進行口蹄疫型別測定,所有病變良好的細胞毒均與所接種的病毒在口蹄疫病毒型上一致。第五、第六代長白仔豬原代細胞毒毒價(lgTCLD50/ml)分別為3.75、4.33;第五、第六代BHK21細胞毒毒價(lgTCLD50/ml)分別為 4.00、4.83。

結果顯示原代細胞毒的病毒毒價略低于平行傳代的BHK21細胞毒。說明長白豬原代心肌細胞對口蹄疫的敏感性和BHK21細胞無差異。

3 討 論

1955年,Cavanough對雞胚心肌細胞進行分離和保存;1960年,Harary和Farley首次培養出Wistar乳鼠的心肌細胞,并維持其自發性節律搏動40d;1977年,Jacobson首次成功培養出成熟心肌細胞;1982年,Piper等又建立了另一種成熟心肌細胞培養模型〔8-9〕。但有關仔豬心肌原代細胞培養的研究國內外報道很少,而用仔豬心肌細胞進行口蹄疫病毒敏感性的研究更是未見報道。

體外培養的心肌細胞能夠保持其在體內原有的許多結構和功能,同時排除了神經、體液等因素的干擾,因此體外培養在心肌細胞的生長、發育、生理、代謝、病理等研究中具有重要意義。同時,體外培養的心肌原代細胞較為純凈,進行病毒感染試驗所得到的試驗數據較為真實,避免了機體因感染其他病原而得到其他不一致的結果。同時用體外細胞模型試驗,可以使試驗過程容易重復。

通常認為,成熟的心肌細胞是終末分化型細胞,不具備有絲分裂能力。成年動物心肌細胞中約有15%～20%較年輕的心肌細胞,保留著增殖的能力。但心肌細胞增殖潛能的大小尚未知曉,缺乏形態學和生物學資料。由于各實驗室所需要解決的問題、實驗材料的取舍、實驗室具體條件不同等,所采用的細胞培養方法也不盡相同。首先,筆者在選擇試驗動物時,在種豬場選擇了出生1日齡的長白仔豬。經試驗證明,出生后1日齡仔豬心肌原代細胞具有較高的細胞活力。其次,消化酶的濃度和消化時間是實驗成功的關鍵。不同的實驗室采用胰酶的濃度從0.05%～0.25%不等,胰蛋白酶濃度過高時,心肌組織中細胞及間質均受到影響,極易把組織消化成為透明粘稠狀液體,使肌原纖維出現萎縮,細胞死亡率增加或喪失貼壁能力及搏動能力;胰蛋白酶濃度過低時,心肌組織消化不足,細胞聚集成團,無法分清細胞邊界,難以進行形態學觀測。同時用單一的胰酶消化心肌組織,容易造成心肌細胞的損傷〔10-12〕。本實驗室采用混合消化酶(用濃度為2g/L胰蛋白酶(trypsin)和1g/LⅡ型膠原酶(collagenase)1∶1混合)消化心肌組織。不同實驗室采用的分次消化時間從5～8 min不等,我們在試驗中發現分次消化時間為8 min時,細胞產量和細胞活力較理想。有的實驗室在心肌消化過程中將心肌消化到透明為止,而我們發現隨著總消化時間的延長細胞活力呈下降趨勢,本實驗室將總的消化時間控制在30 min左右。第三,在進行細胞培養時,組織材料來源、培養液、血清、消化酶、手術器械、培養板等,要嚴格按無菌實驗要求準備,培養過程中具體操作的每一步都應嚴格遵循實驗原則和無菌要求。心肌細胞的觀察、拍照時間不可過長,頻率不可太高,否則能增加污染概率。第四,心肌細胞生長的最適pH值為 7.2～7.4,因此培養液、胰蛋白酶、DHank′s液pH值均應在此范圍內。當pH低于6.8時,對心肌細胞生長會有抑制作用;當pH值大于7.6時,心肌細胞生長亦會受到抑制,且搏動會減弱。第五,心肌細胞的接種密度不僅影響分離細胞的分化表型特征,而且影響心肌細胞的生存時間。心肌細胞之間聯系可促進細胞自發活動的形成。如果心肌細胞接種密度太低,細胞間難進行信息交流,細胞生長不良、細胞難于生存;如果細胞密度太高,則易發生營養不良,且許多細胞難于貼壁生長,在更換培養液時容易被丟失〔13-14〕。本試驗的心肌細胞接種密度為5×105細胞/mL,細胞生長良好,收縮明顯而有力,用顯微鏡可以看到搏動細胞。第六,不同組織來源的細胞其生長所需要的營養物質不同。本實驗室在培養仔豬原代心肌細胞時,曾用過高糖DMEM、低糖DMEM細胞培養液,發現用這兩種培養液培養仔豬原代心肌細胞時,細胞生長緩慢、成活率低、細胞形態不佳等缺點。后來換CMM 6201心肌專用培養液后,細胞形態、生長速度、成活率都明顯變好。綜上所述,本研究介紹的仔豬心肌原代細胞培養方法,細胞貼壁快、搏動早、產量高,活力好而且操作簡便,是一種較為理想的心肌細胞原代培養方法。

據報道,近年來豬口蹄疫逐步表現出發病率平穩,但死亡率卻趨于增高的態勢,尤其是自1998、1999年起個別地方發病豬與先前的病豬比較在流行特點、臨床表現及病情控制等方面都有了相當大的變化。最大的特點是：(1)仔豬發病由先前的腸炎、心肌炎到現在的心肌炎比率增大,而且心肌炎的發病群體也有所擴大,育肥豬心肌炎的死亡率升高;(2)無明顯的口蹄疫癥狀,這就使得病豬在強應激或藥物注射后迅速死亡,給養殖戶造成了較大的經濟損失,同時也延誤了對口蹄疫的有效預防時機。

病毒性心肌炎,致病機制主要為：(1)病毒對心肌直接損傷;(2)由于心肌細胞內在感染病毒后免疫反應所致〔15〕。本試驗首次培養仔豬心肌原代細胞并接種口蹄疫病毒進行敏感性試驗。結果證實長白仔豬的心肌原代細胞對口蹄疫O型乳鼠 適應毒MF6(O/China/99)比較敏感。說明該原代心肌細胞可以作為研究口蹄疫感染誘發仔豬心肌炎致病機理的細胞模型。同時用生長良好的原代細胞接種該O型口蹄疫乳鼠適應毒(MF6),從第2代可以觀察到比較典型的口蹄疫致細胞病變(CPE),且隨著傳代次數的增加病變時間和收毒時間縮短。傳至第6代收毒時間在20h左右,14h出現典型病變(CPE)。用國家口蹄疫參考實驗室生產的間接紅細胞凝集試劑盒和口蹄疫夾心ELISA抗原定型試劑盒檢測,可以檢測到O型口蹄疫病毒抗原,這就說明O型口蹄疫病毒可以在仔豬原代心肌細胞內增殖,造成心肌細胞的損傷。

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