敏感性PCR檢測豬肉弓形蟲方法的建立與應用*

余 莉,朱新伊,胡元生,張俊玲,羅慶禮,沈繼龍

重點實驗室,合肥 230032;

Email：yl_lily@yahoo.com.cn

2.安徽醫科大學第三附屬醫院檢驗科,合肥 230031

我國食源性寄生蟲病病原種類繁多,地區分布廣泛,弓形蟲是其中一種重要的食源性寄生蟲。弓形蟲的中間宿主十分廣泛,多種畜禽如豬、牛、貓、犬、羊、馬、駱駝、家兔、雞、鴨等都可以感染弓形蟲。豬的弓形蟲感染率較高,為3.32%～66.39%〔1〕。豬肉是我國居民日常生活中消費最多的肉制品,食入弓形蟲包囊污染的豬肉及其制品已成為弓形蟲感染的一種重要途徑。

當前,大量研究均集中在對豬血清中弓形蟲抗體的檢測〔2-4〕,這些方法并不能準確反映進入餐桌上的豬肉中弓形蟲的污染狀況。鑒于此,開發一種快速敏感的豬肉弓形蟲檢測方法具有重要的應用價值。目前,分子生物學檢測方法以其簡便、快速、特異、敏感等優勢已被廣泛應用于食品中病原體的檢測中。弓形蟲PCR技術已被應用于人及動物弓形蟲病的診斷,但目前還沒有應用于豬肉中弓形蟲污染檢測的報道。本文利用診斷弓形蟲病的幾種分子標志,如 529bp重復序列(Toxo-529)、B1 、SAG1、SAG2和SAG3基因,將其作為豬肉中弓形蟲檢測靶分子,對其敏感性進行了初步評價,并采用Toxo-529引物檢測了100份豬肉樣本中弓形蟲的污染情況。

1 材料與方法

1.1 細胞、弓形蟲蟲株和動物 人包皮成纖維細胞(HFF細胞)和弓形蟲RH株速殖子均由人獸共患病安徽省重點實驗室液氮保種。8～10周齡KM 小鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑及引物 DMEM培養基為GIBCO公司產品;新生及胎牛血清為杭州四季青公司產品;青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、谷氨酰胺為碧云天公司產品;引物及PCR所用試劑均為大連寶生物公司產品。目標檢測基因及所用引物序列如下所示：(1)529bp重復序列(上游引物5'-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGT TG-3',下游引物 5'-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3',產物長度529bp);(2)B1基因 PCR引物(上游引物：5'-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3',下游引物：5'-TCT T TAAAGCGT TCGTGGTC-3',產物長度194bp);(3)SAG1(上游引物：5'-GGGAATTCTTCACTCTCAAGTGCCCT-3',下游引物：5'-TTGTCGAC-TCAATGCT TCTCAGGCGATC-3',產物長度 650bp);(4)SAG2(上游引物：5'-GAAT TCATGAGT T TCTCAAAGACCACG-3',下游引物：5'-GCGGCCGCT TACACAAACGTGATCAACAAAC-3',產物長度561bp);(5)SAG3(上游引物：5'-GAAT TCATGCAGCTGTGGCGG-3'下游引物：5'-GCGGCCGCT TAGGCAGCCACATGCA-3',產物長度1 158bp)。

1.3 蟲株的復蘇 弓形蟲的復蘇按常規方法進行。待小鼠瀕死前無菌抽取腹水,保存備用。同時收集感染小鼠的腦、心、肝組織,-20℃保存備用。

1.4 HFF細胞的傳代及弓形蟲在HFF上的增殖HFF細胞的復蘇和傳代培養按常規細胞培養方法操作。在HFF細胞生長狀態穩定良好時,吸取含弓形蟲速殖子的腹水約1mL加入培養液。待蟲體將大多數HFF細胞自然裂解時,收集裂解液,取27G針頭及20mL注射器吸入裂解液,再推出,如此反復三次。蟲體懸液于4 000 r/min離心10min,棄上清,加入 PBS重懸蟲體,用血球計數板計數,備用。

1.5 含不同數量弓形蟲豬肉樣本的制備 取血清弓形蟲抗體陰性的豬肉樣本一份,每份 10g,共五份。將豬肉剪碎呈肉泥狀,分別加入0、10、100、1 000和10 000個弓形蟲速殖子,混勻后加入30mL 0.25%胰蛋白酶,37℃水浴消化1h。吸管反復吹打懸液,無菌紗布過濾。收集懸液,4 000 r/min離心10min。棄上清,沉淀用于DNA提取。

1.6 豬肉中弓形蟲DNA的提取 采用酚氯仿法提取DNA。在上述收集的沉淀中加入700μ L裂解緩沖液,37℃溫孵 1h。加蛋白酶 K至終濃度100μ g/mL,56℃溫孵3h。加等體積苯酚-氯仿(3∶1),顛倒混勻10min,8 000r/min離心15min。取水相,加等體積氯仿-異戊醇(24∶1),顛倒混勻10min,8 000r/min離心15min。取水相,加5mol/L NaCl至終濃度0.3 mol/L,再加2.5倍體積的無水乙醇,搖勻,可見絮狀沉淀,10 000r/min離心10min。70%無水乙醇洗滌兩次,干燥后沉淀溶于0.5mL TE。

1.7 弓形蟲不同目的基因的PCR檢測 采用25μ L反應體系,依次加入10μ mol/L 基因特異性上游和下游引物各 1μ L,2.5mmol/L dNTPs 2μ L,25mmol/L MgCl21.5μ L,10 ×buffer 2.5μ L,5U/μ L Taq 0.15μ L,DNA 模板 1μ L,最后加滅菌的去離子水補齊至 25μ L。529bp重復序列、SAG2和SAG3的擴增條件為：94℃10min,94℃1min、55℃1min、72℃1min共30個循環,72℃10min。SAG1的擴增條件為：94℃10min,94℃1min、58℃1min、72℃1min共30個循環,72℃10min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR反應結果。

1.8 市售豬肉樣本的采集處理 從合肥市蜀山區8個不同的菜市場,隨機采集100份豬后腿瘦肉樣本,每份30g,按順序編號。無菌PBS洗凈后,用組織搗碎機絞碎,加50mL 0.25%胰蛋白酶于37℃水浴消化1h。吸管反復吹打懸液,無菌紗布過濾。收集懸液,4 000r/min離心10min。棄上清,沉淀用于DNA的提取。DNA的提取方法同1.6項。DNA樣本用Toxo-529引物進行PCR檢測。

2 結 果

2.1 不同引物的PCR檢測結果 Toxo-529引物PCR檢測結果見圖1和圖2。含10個弓形蟲速殖子的豬肉樣本未見特異性條帶;含 100、1 000和10 000個弓形蟲速殖子的豬肉樣本均在529bp位置擴增出特異性條帶,亮度依次增強。弓形蟲感染小鼠腦組織、心臟組織和肝臟組織均擴增出特異性條帶。B1引物PCR檢測結果見圖3。含10和100個弓形蟲速殖子的豬肉樣本在194bp處未見特異性條帶,含1 000個弓形蟲速殖子的豬肉樣本可見弱的特異性條帶。弓形蟲感染小鼠的不同組織中只有腦組織中檢測到了特異性條帶。SAG1引物PCR檢測結果見圖4。除了作為陽性對照的弓形蟲速殖子樣本在650bp處擴增出了特異性條帶,其他樣本均未擴增出特異性條帶。SAG2引物PCR檢測結果見圖5。所有的檢測樣本中除了陽性對照在561bp處可見明顯的條帶外,只有含10 000個弓形蟲速殖子的豬肉樣本和弓形蟲感染小鼠的肝臟組織可擴增出弱的特異性條帶。SAG3引物PCR檢測結果見圖6。除了作為陽性對照的弓形蟲速殖子樣本在1 158bp處擴增出了特異性條帶,其他樣本均未擴增出特異性條帶。

2.2 市售豬肉中Toxo-529目標基因的檢測結果在隨機抽取的100份市售豬肉中有17份PCR檢測陽性,陽性率為17%。其中編號為24(圖7)和35(圖8)的為強陽性,在529bp處可見清晰條帶。

3 討 論

病原學診斷是食品中致病性微生物檢測的“金標準”,對豬肉中弓形蟲感染的檢查亦然。但傳統的弓形蟲的涂片鏡檢、動物或細胞接種分離培養,敏感性很低,且費時費力,操作繁瑣。故研發高敏感度、快速、簡單易行的檢測方法對于肉食品弓形蟲檢驗十分重要。

PCR技術已廣泛應用于微生物的病原學診斷。多拷貝數的目標基因有助于提高PCR檢測的敏感性〔5〕。B1基因是較早應用于PCR檢測的弓形蟲靶基因,在整個基因組中有35個拷貝的串聯重復片段,其功能尚不清楚,但在診斷弓形蟲方面的特異性得到一致的公認〔6-8〕。在2000年,Homan等又發現了一個529bp的弓形蟲特異性基因,該基因在基因組中多達 300多個拷貝〔9〕。運用實時熒光定量PCR研究表明,Toxo-529基因的敏感性是B1基因的10倍〔10〕。該研究進一步運用Toxo-529為目標基因檢測了5個實驗室保存蟲株、7個患者腦脊液來源的分離株、51份弓形蟲病患者腦脊液標本、160例非活動性臨床患者標本及118個細菌分離株。陽性結果只見于弓形蟲蟲株和確診的弓形蟲病患者腦脊液標本,陰性結果見于所有的陰性對照樣本,包括血清弓形蟲血清學陽性而無弓形蟲病臨床癥狀的人群。結果表明,基于檢測Toxo-529基因的PCR檢測具有高度的特異性。另外,在弓形蟲的單拷貝基因中,SAG1、SAG2及SAG3也被用作PCR檢測的靶序列〔5,11-12〕。在本研究中,模擬了不同數量弓形蟲感染的豬肉樣本,分別以T oxo-529基因、B1基因、SAG1、SAG2、SAG3作為目標檢測基因。結果表明,多拷貝基因的敏感性明顯高于單拷貝基因。在SAG1、SAG2、SAG3三個單拷貝基因中,只有用SAG2作為目標檢測基因時,在10 000個弓形蟲速殖子模擬感染的豬肉樣本看到微弱的特異性條帶,而以SAG1和SAG3作為目標檢測基因時,從10-10 000個速殖子感染的豬肉樣本中均未檢測到特異性條帶。B1基因作為一個多拷貝基因被發現后,Ho-yen等于1992年成功建立了一種巢式PCR方法用于檢測病人血液樣品中的弓形蟲,并在既往的研究中得到廣泛應用〔13〕。但巢式PCR增加了一輪PCR擴增,費時費力,且易出現PCR產物的污染,呈現假陽性。本研究用普通PCR方法對B1基因和Toxo-529基因的敏感性進行了比較,結果與上述的熒光定量PCR方法檢測的結果一致。Toxo-529能檢測100個速殖子/10g豬肉,而B1基因能檢測1 000個速殖子/10g豬肉,其敏感性是B1基因的10倍。上述數據表明,Toxo-529基因是一個用于肉制品中弓形蟲PCR檢測的理想靶標。

基于此,我們用 Toxo-529基因作為檢測的靶標,對合肥市西市區菜市場采集的100份豬肉樣本中弓形蟲的感染進行檢測,陽性率為17%。該研究對于明確我國市售豬肉的弓形蟲污染情況和指導居民建立健康的飲食習慣具有重要的參考價值。

〔1〕張居作,陳漢忠,徐君飛.我國弓形蟲的感染現狀〔J〕.動物醫學進展,2008,29(7)：101-104.

〔2〕朱繼斌.河北省豬弓形蟲感染情況調查〔J〕.河北北方學院學報,2006,22(2)：46-48.

〔3〕韓秀敏.西寧市商品豬人獸共患寄生蟲病感染情況調查〔J〕.青海畜牧獸醫雜志,2001,31(2)：21-22.

〔4〕米曉云,巴音查汗,李文超.新疆豬、牛、羊弓形蟲病的血清學調查〔J〕.中國獸醫寄生蟲病雜志,2007,15(2)：22-24.

〔5〕Switaj K,Master A,Skrzypczak M,et al.Recent trends in molecular diagnostics forToxoplasma gondiiinfections〔J〕.Clin Microbiol Infect,2005,11(3)：170-176.

〔6〕Burg JL,Grover CM,Pouletty P,et al.Direct and sensitive detection of a pathogenic protozoan,Toxoplasma gondii,by polymerase chain reaction〔J〕.J Clin Microbiol,1989,27(8) ：1787-1792.

〔7〕Esteban-Redondo I,Maley SW,Thomson K,et al.Detection ofT.gondiiin tissues of sheep and cattle following oral infection〔 J〕.Vet Parasitol,1999,86(3)：155-171.

〔8〕Montoya A,Miro G,M ateo M,et al.Detection ofToxoplasma gondiiin cats by comparing bioassay in mice and polymerase chain reaction(PCR)〔J〕.Vet Parasitol,2009,160(2) ：159-162.

〔9〕Homan WL,Vercammen M,DeBraekeleer J,et al.Identification of a 200-to 300-fold repetitive 529 bp DNA fragment inToxoplasma gondiiand its use for diagnostic and quantitative PCR〔J〕.Int J Parasitol,2000,30(1)：69-75.

〔10〕Reischl U,Bretagne S,Kruger D,et al.Comparisi on of two DNA targets for the diagnosis of toxoplasmosis by real time PCR using fluorescence resonance energy transfer hybridization probes〔 J〕.BMC Infect Dis,2003,3 ：7.

〔11〕Warnekulasuriya M R,Johnson J D,Holliman R E.Detection ofToxoplasma gondiiin cured meats〔J〕.Int J Food Microbiol,1998,45(3)：211-215.

〔12〕Dubey JP,Hill DE,Jones JL,et al.Prevalence of viableToxoplasma gondiiin beef,chicken,and pork from retail meat stores in the United States ：risk assessment to consumers〔J〕.J Parasitol,2005,91(5)：1082-1093.

〔13〕Ho-yen DO,Joss AW,Balfour AH,et al.Use of the polymerase chain reaction to detectToxoplasma gondiiin human blood samples〔J〕.J Clin Pathol,1992,45(10)：910-913.