激素對蟬擬青霉深層液體發酵生長代謝的調控作用

陳安徽，王衛東，陳宏偉，韓福海，李 念

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

激素對蟬擬青霉深層液體發酵生長代謝的調控作用

陳安徽，王衛東，陳宏偉，韓福海，李 念

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

以生物量、腺苷產量、胞內多糖產量和蟲草素產量為指標，考察不同添加量的細胞分裂素6-芐氨基嘌呤(6-BA)和保幼激素Ⅲ對蟬擬青霉深層液體發酵的調控作用。各實驗組在整個發酵過程中的生長代謝節奏與對照組有一定的差異性，兩種激素均具有提高蟬擬青霉生物量的作用，其中6-BA添加量為4mg/L時比對照組提前12h到達生物量最大值，并且其最大生物量較對照組最大生物量提高了28.96%。兩種激素均可調節蟬擬青霉菌絲體中活性物質的代謝節奏，低劑量6-BA可顯著提高胞內多糖產量(P＜0.05)；而保幼激素Ⅲ中、高兩劑量組則在培養36h以后表現出了明顯抑制多糖合成的作用(P＜0.05)。蟲草素和腺苷產量分析結果也表明激素可改變兩種活性物質的代謝節奏。

蟬擬青霉；液體發酵；激素；代謝調控

蟲草是一類十分重要的昆蟲病原真菌，隸屬于子囊菌門(Ascomycotina)，核菌綱(Pyrenomycetes)，麥角菌科(Clavicipitales)，蟲草屬(Cordyceps)，具有種類多、數量大、代謝產物多樣性及多種藥理活性等特點[1-2]。蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae(Mique1)Samson)為一種世界性分布的昆蟲病原真菌，被認為是大蟬草的分生孢子無性型階段[3-4]。蟬擬青霉含有糖原、甘露醇、生物堿及麥角甾醇等多種活性物質，具有鎮靜催眠、提高免疫等多種功效[5-8]。現代研究表明：植物激素和昆蟲激素均對微生物的生長發育具有一定的調控作用。汪宇等[9]研究證實，植物生長調節劑如萘乙酸、吲哚丁酸等能促進蟲草液體發酵物的生成；施明珠等[10]研究發現昆蟲保幼激素改變了蛹蟲草菌絲體生長代謝節奏，對處于特定菌齡期的蛹蟲草生長代謝具有調控作用。本實驗選擇細胞分裂素6-芐氨基嘌呤(6-BA)和昆蟲保幼激素Ⅲ作為實驗材料，分析蟬擬青霉液體發酵過程中菌絲體生長及菌絲體中蟲草素、腺苷、胞內多糖的變化規律，探索激素對蟬擬青霉生長發育的調控作用，為進一步推動蟲草資源開發利用提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌種與試劑

蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)菌株(菌株編號PC05-4) 徐州泰克生物科技有限公司。

細胞分裂素6-芐氨基嘌呤(6-BA)、保幼激素Ⅲ、蟲草素、腺苷 Sigma公司；磷酸二氫銨、石油醚、無水乙醇和濃硫酸等均為國產分析純。

1.1.2 培養基

固體斜面培養基(g/L)：葡萄糖40、蛋白胨10、酵母浸出粉10、瓊脂20；液體種子培養基(g/L)：葡萄糖40、蛋白胨10、酵母浸出粉10；液體發酵培養基(g/L)：葡萄糖20、白砂糖20、酵母粉20、蛋白胨10、KH2PO40.5、MgSO4·7H2O 0.1、CaCl20.2。

1.1.3 儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；5L四聯液體發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；TUMEN TL-15高速離心機 江蘇圖們離心機廠；梅特勒AE200型電子天平 上海分析儀器廠；FREEZONE12凍干機 美國Labconco公司。

1.2 方法

1.2.1 6-BA和保幼激素Ⅲ處理方法

將3種不同劑量(低劑量組2mg/L、中劑量組4mg/L、高劑量組8mg/L)細胞分裂素6-BA分別添加到四聯發酵罐的隨機3個發酵罐培養基中，剩余發酵罐培養基中不添加任何物質作為空白對照組，按照1.2.2節所述方法進行發酵培養，并進行相關指標的測定，所有實驗均重復3次。保幼激素Ⅲ處理方法同6-BA。

1.2.2 生物量測定及菌絲體獲得

用液體發酵培養基，以10%的接種量接入一級液體種子，置于5 L四聯液體發酵罐(每個罐內裝培養基3200mL)，25℃無菌條件下培養，攪拌機轉速120r/min，通氣量(0.8～1):1，罐壓0.05～0.08MPa，每隔12h取樣一次，每次取樣100mL，將所取發酵醪采用布氏漏斗真空抽濾將發酵液和菌絲體分離，用蒸餾水反復沖洗菌絲體3～5次，濕菌絲體冷凍干燥處理。干燥菌絲體經粉碎過100目篩后低溫、避光保存以便進行相關指標分析。

1.2.3 胞內多糖產量的測定

稱取適量菌絲體樣品，置于索氏提取器中，加乙醚100mL于圓底燒瓶中，回流提取至無色；對提取所得殘留物加20倍量熱水回流提取1h，重復兩次；將水提液濃縮至25mL，加無水乙醇至體積分數為75%，放入4℃冰箱，靜置12h；將醇沉過的濃縮水提液于10000r/min離心10min，除去上清液，沉淀用無水乙醇、丙酮依次洗滌3次，冷凍干燥后，即得粗胞內多糖，用硫酸-蒽酮法測定多糖產量[11]。

1.2.4 蟲草素和腺苷產量的測定

標準曲線的繪制：精確稱取腺苷和蟲草素標準品各10mg，置于10mL的容量瓶，用75%乙醇溶解、搖勻，并定容至刻度，得兩種標準樣品質量濃度均為1mg/mL的混合標準品溶液，用75%乙醇將標準品溶液稀釋至適當質量濃度，進行HPLC分析，繪制標準曲線。

取適量菌絲體樣品置于25mL容量瓶，加入75%乙醇20mL，超聲提取60min(功率250W，頻率33kHz)，過濾，濾液用75%乙醇定容至刻度后混勻，所得液體經過0.22μm微孔濾膜過濾后，所得濾液即為樣品液，稀釋后進行HPLC分析。

高效液相色譜條件：0.01mol/L磷酸二氫銨溶液為A液，甲醇為B液，洗脫梯度設置為：100% A液5min、80% A液+20% B液 5min、60% A液+40% B液 20min、100% B液10min、100% A液10min；流速1.0mL/min，柱溫40℃，UV檢測波長：260nm；進樣量：20μL。

1.2.5 實驗數據統計方法

實驗數據用平均值±標準差表示，統計方法為多重方差分析，用SPSS13.0統計軟件處理。

表1 激素對蟬擬青霉液體深層發酵生物量變化的影響±s, n=3)Table 1 Effect of hormone on biomass change in P. cicadae during submerged fermentation (±s, n=3)

表1 激素對蟬擬青霉液體深層發酵生物量變化的影響±s, n=3)Table 1 Effect of hormone on biomass change in P. cicadae during submerged fermentation (±s, n=3)

5.13±0.33 11.19±0.23 14.55±0.41 18.96±0.47 18.37±0.55 13.33±1.05細胞分裂素6-BA 中 4.69±0.26 11.89±0.19 15.84±0.38 22.89±0.71 20.16±1.03 15.01±1.09高3.77±0.35 11.75±0.83 14.62±0.19 20.66±0.83 19.75±0.79 15.88±0.94低3.14±0.17 7.98±0.37 13.17±0.45 19.49±0.62 18.83±0.65 19.18±1.35保幼激素Ⅲ 中 3.53±0.16 8.73±0.44 14.78±0.97 21.43±0.44 18.44±0.96 16.69±0.84高3.09±0.18 8.02±0.51 14.06±1.09 20.16±0.59 16.53±1.21 14.11±0.55對照組 4.15±0.13 9.57±0.16 12.78±0.24 16.49±0.29 17.75±0.87 15.38±0.37激素 劑量組 不同發酵時間生物量/(g/L)12h 24h 36h 48h 60h 72h低

表2 激素對蟬擬青霉液體發酵過程中胞內多糖產量的影響±s,n=3)Table 2 Effect of hormone on intracellular polysaccharide change in P. cicadae during submerged fermentation±s,n=3)

表2 激素對蟬擬青霉液體發酵過程中胞內多糖產量的影響±s,n=3)Table 2 Effect of hormone on intracellular polysaccharide change in P. cicadae during submerged fermentation±s,n=3)

激素 劑量組 不同發酵時間胞內多糖產量/(mg/g)12h 24h 36h 48h 60h 72h低 26.27±2.68 34.66±0.78 35.11±1.11 47.13±3.88 41.02±2.65 33.11±1.77細胞分裂素6-BA 中 26.18±1.34 36.95±1.13 32.13±2.01 31.33±1.65 30.12±3.06 25.62±2.36高 27.65±1.55 37.15±0.97 33.11±1.52 32.19±0.97 31.22±2.36 26.87±1.59低 37.13±1.78 39.13±1.85 35.55±3.11 34.36±1.33 29.11±1.56 24.32±1.55保幼激素Ⅲ 中 34.79±0.96 34.19±2.77 33.74±1.13 27.02±2.17 26.30±0.92 25.11±1.62高 35.01±1.33 33.14±1.55 32.18±1.66 25.14±3.12 26.12±0.44 14.88±1.03對照組 25.06±0.81 29.17±1.31 30.09±2.35 31.98±1.25 33.78±1.14 32.01±1.22

表3 激素對蟬擬青霉液體深層發酵蟲草素產量的影響(±s,n=3)Table 3 Effect of hormone on cordycepin change in P. cicadae during submerged fermentation ±s,n=3)

表3 激素對蟬擬青霉液體深層發酵蟲草素產量的影響(±s,n=3)Table 3 Effect of hormone on cordycepin change in P. cicadae during submerged fermentation ±s,n=3)

0.56±0.041 1.17±0.01 1.49±0.09 1.68±0.04 1.34±0.09 1.01±0.05細胞分裂素6-BA 中 0.83±0.07 1.29±0.05 1.63±0.06 2.85±0.08 1.91±0.04 1.37±0.08高1.02±0.03 1.17±0.05 1.32±0.04 1.53±0.07 1.25±0.07 0.96±0.06低0.95±0.08 1.16±0.12 1.87±0.12 1.12±0.08 0.09±0.04 0.86±0.06保幼激素Ⅲ 中 0.82±0.12 1.28±0.06 1.84±0.10 1.47±0.06 1.01±0.06 1.02±0.09高1.04±0.10 1.05±0.04 1.74±0.07 1.25±0.08 1.32±0.04 1.09±0.05對照組 0.46±0.03 0.76±0.03 1.08±0.04 1.19±0.07 1.25±0.06 0.93±0.05激素 課題組 不同發酵時間菌絲體中蟲草素產量/(mg/g)12h 24h 36h 48h 60h 72h低

2 結果與分析

2.1 生物量

將細胞分裂素6-BA和保幼激素Ⅲ按一定劑量添加到蟬擬青霉液體發酵培養基中，研究不同劑量組在不同培養時間段的菌絲體干質量，考察激素對蟬擬青霉生物量的影響，結果如表1所示。

由表1可知，在本實驗條件下細胞分裂素6-BA和保幼激素Ⅲ均具有一定的提高蟬擬青霉最大生物量的作用。細胞分裂素6-BA中劑量組與保幼激素Ⅲ中劑量組最大生物量分別達到22.89g/L和21.43g/L，兩實驗組之間差異達顯著水平(P＜0.05)，此兩實驗組與對照組最大生物量相比，差異均達顯著水平(P＜0.05)。不同劑量細胞分裂素6-BA對蟬擬青霉生物量的影響有所差異，中劑量細胞分裂素6-BA對蟬擬青霉最大生物量影響最為顯著(P＜0.05)，與對照組最大生物量(17.75g/L)相比其最大生物量提高28.96%；實驗數據也表明細胞分裂素6-BA顯著縮短了蟬擬青霉的發酵周期，實驗組比對照組提前12h達到生物量最大值。保幼激素Ⅲ也可縮短蟬擬青霉的發酵周期，提前達到最大生物量，但隨著培養時間的延長，低劑量保幼激素Ⅲ可較長時間維持較高生物量，培養72h時，生物量依然維持在19.18g/L，而其他兩劑量組生物量則出現了快速降低的現象。

2.2 胞內多糖產量的變化

由表2可知，發酵48h時低劑量細胞分裂素6-BA對蟬擬青霉胞內多糖產量的影響最為顯著，胞內多糖的產量高達47.13mg/g，與細胞分裂素6-BA其他兩個劑量組及對照組相比差異均達顯著水平(P＜0.05)，胞內多糖產量比對照組提高了47.37%；高劑量和中劑量組僅在發酵24h時比對照組胞內多糖產量有顯著提高(P＜0.05)，隨著培養時間的延長，中、高劑量細胞分裂素6-BA提高蟬擬青霉胞內多糖產量的影響逐漸消失，至培養結束(發酵72h)時，中、高劑量細胞分裂素6-BA實驗組對蟬擬青霉胞內多糖反而出現了抑制現象，兩劑量組多糖產量均顯著低于發酵72h時對照組多糖產量(P＜0.05)，但這兩劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05)。

保幼激素Ⅲ 3個劑量組在發酵前期(36h以前)均對蟬擬青霉有提高胞內多糖產量的作用，胞內多糖產量均顯著高于對照組(P＜0.05)，培養36h以后直至發酵結束時，中劑量和高劑量保幼激素Ⅲ均對蟬擬青霉胞內多糖的合成表現出了明顯的抑制作用(P＜0.05)，低劑量組在培養48h以后也對蟬擬青霉胞內多糖的產量表現出一定的抑制作用，但培養時間為48h時，低劑量組胞內多糖產量仍然達到34.36mg/g，依然顯著高于對照組。

2.3 蟲草素和腺苷產量的變化

將不同質量濃度蟲草素和腺苷標準品溶液的HPLC 峰面積進行回歸統計分析，即可得蟲草素和腺苷產量的回歸方程。蟲草素產量回歸方程為：y=16.214x－61.232，R2=0.9972，線形范圍為0.0025～0.1250mg/mL；腺苷產量回歸方程為：y=14.931x－82.34，R2=0.9981，線形范圍為0.0025～0.1250mg/mL。兩種標準品在質量濃度范圍內，質量濃度與峰面積均顯現良好的線形關系，在測定樣品時即可根據樣品的峰面積通過以上關系式進行菌絲體中蟲草素和腺苷產量的定量分析，結果見表3、4。

表4 激素對蟬擬青霉液體發酵菌絲體腺苷產量的影響(±s,n=3)Table 4 Effect of hormone on adenosine change in P. cicadae during submerged fermentation (±s, n=3)

表4 激素對蟬擬青霉液體發酵菌絲體腺苷產量的影響(±s,n=3)Table 4 Effect of hormone on adenosine change in P. cicadae during submerged fermentation (±s, n=3)

0.41±0.03 0.66±0.026 0.81±0.02 1.28±0.01 1.13±0.02 0.90±0.06細胞分裂素6-BA 中 0.50±0.04 0.73±0.05 0.88±0.04 1.60±0.05 1.22±0.08 0.83±0.05高0.57±0.01 0.85±0.03 0.98±0.03 1.68±0.06 1.31±0.03 0.86±0.03低0.98±0.03 1.22±0.04 0.94±0.01 0.82±0.08 0.85±0.05 0.79±0.07保幼激素Ⅲ 中 0.83±0.06 1.01±0.09 1.36±0.04 0.81±0.06 0.88±0.06 0.80±0.05高0.66±0.02 1.37±0.03 1.68±0.02 0.88±0.03 0.88±0.05 0.81±0.02對照組 0.25±0.01 0.44±0.02 0.59±0.02 0.79±0.03 0.91±0.03 0.84±0.03激素 劑量組 不同發酵時間菌絲體中腺苷產量/(mg/g)12h 24h 36h 48h 60h 72h低

由表3可知，對照組菌絲體中蟲草素產量隨發酵時間的延長在60h時達到最大值，發酵48h時蟬擬青霉菌絲體中蟲草素產量已經達到1.19mg/g，發酵60h時蟲草素產量為1.25mg/g，雖較培養48h時略有提高，但二者之間差異不顯著(P＞0.05)。在0～48h發酵周期內，發酵時間相同時細胞分裂素6-BA 的3個劑量組菌絲體中蟲草素產量均較對照組有顯著提高(P＜0.05)，其中中劑量組在發酵48h時蟲草素產量最高，蟲草素產量高達2.85mg/g，比相應發酵時間的對照組蟲草素產量提高了139.50%，此時中劑量組菌絲體中蟲草素產量也顯著高于高、低兩個劑量組(P＜0.05)。

保幼激素Ⅲ 3個劑量組在發酵前36h時菌絲體蟲草素產量均顯著高于對照組(P＜0.05)，并且在培養36h時低、中、高3個劑量組均已達到最高，分別為1.87、1.84mg/g和1.74mg/g，比對照組發酵48h時蟲草素最高產量分別提高了57.14%、54.62%和46.22%，但是這3個劑量組蟲草素產量之間無顯著性差異(P＞0.05)。保幼激素Ⅲ低、中、高 3 個劑量組與發酵36h時相比各劑量組菌絲體中蟲草素產量均隨著發酵時間的延長而逐漸降低，至實驗結束(發酵72h)時3個劑量組蟲草素產量與對照組相比已無顯著性差異(P＞0.05)，這說明在本實驗條件下保幼激素Ⅲ對蟬擬青霉液體發酵菌絲體中蟲草素含量的影響主要表現在培養前期階段(培養時間0～36h)。

由表4可知，細胞分裂素6-BA在蟬擬青霉60h發酵時間內可顯著影響其菌絲體中腺苷產量(P＜0.05)。在培養48h時細胞分裂素6-BA低、中、高 3 個劑量組腺苷產量均達到最高，腺苷產量分別為1.28、1.60、1.68mg/g，比對照組分別提高了62.03%、102.53%和112.66%，經統計分析高、中兩個劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05)，但兩個劑量組腺苷產量均顯著高于低劑量組(P＜0.05)。

3個保幼激素Ⅲ劑量組在發酵12、24h和36h時蟬擬青霉菌絲體中腺苷產量均顯著高于相應發酵時間的對照組菌絲體中腺苷的產量(P＜0.05)。在發酵12h時，保幼激素Ⅲ低劑量組菌絲體中腺苷產量高達0.98mg/g，是對照組發酵12h時菌絲體中腺苷產量的3.92倍，也顯著高于相應發酵時間的中、高兩個劑量組菌絲體中腺苷的產量(P＜0.05)；在發酵24h時，保幼激素Ⅲ高劑量組菌絲體中腺苷的產量相對最高，其產量高達1.37mg/g，顯著高于相應發酵時間的中、低兩個劑量組及對照組(P＜0.05)；在發酵36h時，保幼激素Ⅲ高劑量組菌絲體中腺苷產量達到最高，為1.68mg/g，顯著高于其他兩個劑量組和對照組菌絲體中腺苷的最高產量(P＜0.05)。

3 討 論

由于當前天然蟲草資源掠奪式的開發，再加上蟲草生長環境的日趨惡化，致使天然蟲草相對短缺，已遠遠不能滿足市場需求，人們已逐步采用人工發酵蟲草菌絲體替代天然蟲草生藥的方法解決當前天然蟲草生藥供需的矛盾，蟲草屬相關真菌發酵工藝及活性物質代謝調控也已成為當前的研究熱點之一。現有研究表明激素可作為一種有效的基因開關而起作用，從而促進細胞中靶基因的表達及DNA、RNA和蛋白質等物質的合成[12]，本研究結果表明，細胞分裂素6-BA和保幼激素Ⅲ對蟬擬青霉液體發酵菌體生長的代謝調控不僅僅表現在最大生物量的提高，同時也表現在對菌絲體生長速度的調控上，如細胞分裂素6-BA可將蟬擬青霉最大生物量的發酵周期由60h提前到48h，但是不同質量濃度的激素對蟬擬青霉菌絲體生長速度的影響是不同的，如在同等條件下，中劑量保幼激素Ⅲ可使蟬擬青霉最大生物量提高20.73%，而低劑量保幼激素Ⅲ僅使蟬擬青霉最大生物量提高了9.80%。從蟬擬青霉菌絲體中胞內多糖、腺苷和蟲草素3種活性物質的積累情況看，細胞分裂素6-BA和保幼激素Ⅲ不僅可以調控活性物質的代謝節奏也能調節其最大產量。本研究結果表明在蟬擬青霉液體深層發酵過程中，可以通過添加某些激素調控其生長代謝和活性物質的積累，以便根據目標產物有針對性的選擇最佳的發酵工藝，這也可為其他相關蟲草屬真菌發酵代謝調控工藝的研究提供一定的參考。

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Regulatory Effect of Hormones on the Growth and Metabolism of Paecilomyces cicadae in Submerged Fermentation

CHEN An-hui，WANG Wei-dong，CHEN Hong-wei，HAN Fu-hai，LI Nian
(College of Food(Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

The regulatory effects of separated added 6-benzylaminopurine and juvenile hormone III before the submerged fermentation of Paecilomyces cicadae on the mycelial growth, intracellular polysaccharide (IPS), cordycepin and adenosine production were explored. The rhythm of mycelial growth and metabolism were different between the control group and the test groups during the whole fermentation process. Two hormones had an promotion effect on the maximum biomass of Paecilomyces cicadae, the biomass of Paecilomyces cicadae was increased by 28.96% and the fermentation time could shorten to 12 h when 6-benzylaminopurine was added at a concentration level of 4 mg/L. In addition, 6-benzylaminopurine and juvenile hormone III could regulate the metabolic rhythm of bioactive materials in Paecilomyces cicadae. The content of IPS was notably increased when 6-benzylaminopurine was added at the low concentration (2 mg/L) (P ＜ 0.05), and juvenile hormone III had an significant inhibitory effect at a concentration level of 4(middle) or 8 mg/L(high) after fermentation for 36 h (P ＜ 0.05). Furthermore, both kinds of hormones also could change the metabolic rhythm of cordycepin and adenosine based on their productivity during the fermentation.

Paecilomyces cicadae；liquid fermentation；hormone；regulatory effect

S567.3

A

1002-6630(2010)23-0317-05

2010-08-25

江蘇省教育廳高校自然科學基金項目(09JYD180007 )；徐州工程學院校內科研課題(XKY2008111)

陳安徽(1979—)，男，講師，博士，研究方向為應用微生物學、生物制藥。E-mail：chenah201@163.com