Interdelta PCR 指紋圖譜法區分鑒定沙城產區釀酒酵母

趙靜靜，李 艷,2,*，張利中，莊玉婷

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊050018；3.中國長城葡萄酒有限公司，河北 沙城 075400)

Interdelta PCR 指紋圖譜法區分鑒定沙城產區釀酒酵母

趙靜靜1，李 艷1,2,*，張利中3，莊玉婷1

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊050018；3.中國長城葡萄酒有限公司，河北 沙城 075400)

運用Interdelta PCR指紋圖譜分析技術，對從沙城產區龍眼葡萄相關的葡萄園土壤、釀酒設備和自然發酵過程中分離得到的54株釀酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)進行亞種水平的區分鑒定，研究不同釀酒酵母的分布和變化規律。結果表明：54株釀酒酵母產生7種指紋圖譜，代表7種不同的基因類型，基因型Ⅰ～Ⅶ分別占所分離菌株的31.5%、11.1%、7.4%、42.6%、3.7%、1.85%和1.85%。自然發酵中后期有4種基因類型的酵母菌，釀酒設備表面3種，葡萄園土壤中2種。通過聚類分析軟件處理所得數據作出樹形圖，可直觀地看出亞種第Ⅰ和第Ⅳ的親緣關系最近，而第Ⅶ與其他亞種的親緣關系最遠。

釀酒酵母；Interdelta PCR；區分鑒定；聚類分析；沙城產區；龍眼葡萄

葡萄酒釀造過程是包括細菌、酵母菌和霉菌在內的微生物作用的結果，其中酵母菌對葡萄酒中化合物的形成和最終酒香的產生起到尤為重要的作用。在葡萄酒發酵初期，非釀酒酵母(non-Saccharomyces)，如假絲酵母(Candida)、有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)、畢赤酵母(Pichia)、克魯維酵母(Kluyveromyces)等占有主導優勢，但隨著發酵的進行，發酵液中乙醇濃度越來越高，對乙醇具有較高耐受力的釀酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)漸漸取代非釀酒酵母成為主導菌，并最終完成發酵過程[1]。許多文獻報道了不同釀酒酵母對發酵所得葡萄酒揮發性化合物形成及感官品質的影響[2-3]，可見酵母菌種的選取在生產中的重要性。目前，我國葡萄酒生產中大量使用商品活性干酵母，優良的酵母菌能夠保證發酵的正常進行和產品質量的穩定性，然而大家都使用商用酵母必然導致葡萄酒風味的雷同和單一，這正是篩選葡萄酒產區本土釀酒酵母以釀造具有獨特風味葡萄酒的必要性[4]。

釀酒酵母往往存在于葡萄園和酒廠環境中。如酒廠設備表面或破碎的葡萄上釀酒酵母存在的概率很大[5]。先前的報道顯示，在葡萄園土壤和葡萄漿果表面很少能篩選到釀酒酵母[6]。本研究室于2008—2009年從河北沙城釀酒葡萄產區的懷來縣沙城鎮沙營、夾河和東水泉3個自然村的龍眼葡萄園土壤、中國長城葡萄酒有限公司釀酒車間設備、龍眼葡萄酒的自然發酵過程等分別采集土壤、葡萄鮮果、葡萄汁、龍眼葡萄自然發酵液和擦拭設備表面等樣品共計184份。經過傳統的表型分類和5.8S-ITS區域、26S D1/D2區域的RFLP分析和基因測序，得到了54株釀酒酵母(S. cerevisiae)，它們主要來自葡萄園土壤、葡萄汁和自然發酵的中后期。本實驗采用Interdelta PCR指紋圖譜法[7-8]對這54株釀酒酵母菌進行亞種水平的區分，對區分結果進行聚類分析，得出物種進化樹形圖，使分類進一步接近自然分類系統。

1 材料與方法

1.1 出發菌株

本研究室于2008—2009年從沙城產區采集的184份菌樣中，經分離、鑒定和測序確定54株釀酒酵母(S. cerevisiae)，這些菌的采樣地點、采樣時間及菌株編號如表1所示。

表1 釀酒酵母菌株來源及編號Table 1 Geographic sources and numbers of S. cerevisiae strains

1.2 試劑與培養基

Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、Colorless GoTaq Reaction Buffer Promega公司；十二烷基磺酸鈉(SDS表面活性劑)、100bp DNA LadderⅠ(生化試劑) 北京鼎國生物技術有限公司；dNTP Mixture(生化試劑) Toyobo公司；引物δ12(5＇-TCAACAATGGAATCCCAAC-3＇)和δ 2(5＇-GTGGATTTTTATTCCAACA-3＇) 上海生物工程技術服務有限公司。

YEPD 培養基(%)：酵母浸粉 1.0、蛋白胨 2.0、葡萄糖 2.0、瓊脂 2.0；WL培養基(%)：酵母浸粉 0.4、蛋白胨 0.5、葡萄糖 5、瓊脂粉 2、KH2PO40.055、KCl 0.0425、CaCl20.0125、MgSO40.0125、FeCl30.00025、MnSO40.00025，溴甲酚氯22mg/mL。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌單菌落分離

將篩選得到的保藏釀酒酵母菌稀釋涂布在YEPD培養基平板上，25℃培養，經過多次劃線分離得到單菌落。

1.3.2 酵母菌DNA提取

SDS裂解法：挑取新鮮菌體于盛有30μL 0.25% SDS溶液的EP管中，漩渦振蕩15s。在90℃熱激4min，再冰浴5min，然后13000r/min離心1min，取上清液20μL至新的EP管中，－20℃保藏備用。

1.3.3 Interdelta PCR指紋圖譜法區分鑒定酵母菌株

反應體系(50μL)：引物δ12、δ2各1μmol/L；dNTP 0.2mmol/L；Colorless GoTaq Reaction Buffer 10μL；TaqDNA聚合酶0.5μL；模板DNA 1μL。反應條件：97℃預變性4min；94℃變性30s，45℃退火1min，72℃延伸2min，循環30次；再72℃延伸10min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠75V電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母菌的鑒定

圖1 釀酒酵母菌落形態(A)及顯微形態(B)Fig.1 Colony and microscopic morphology of Saccharomyces cerevisiae

本實驗室于2008—2009年采集的184份樣品經過分離篩選共得到960株酵母菌。經過稀釋涂布和反復劃線培養得到單菌落，再進行5.8S-ITS區域和26S D1/D2區域的RFLP分析和基因測序，最終確定54株釀酒酵母，分別來自4個不同地點及時間(表1)，釀酒酵母占總篩得菌數的5.6%。釀酒酵母菌落為白色偏微綠色、火山狀凸起、表面光滑、邊緣整齊，其菌落及顯微形態見圖1。5.8S-ITS區域和26S D1/D2區域的RFLP分析結果見表2。5.8S-ITS區域和26S D1/D2區域PCR擴增產物的凝膠電泳圖譜及分別用3種限制性核酸內切酶CfoI、HaeIII和HinfI酶切PCR擴增產物的凝膠電泳圖譜見圖2。

表2 5.8S-ITS區域和26S D1/D2區域的RFLP分析結果Table 2 Results of RFLP analysis of 5.8S-ITS and 26S D1/D2 regions

圖2 5.8S-ITS區域和26S D1/D2區域PCR擴增產物及3種限制性核酸內切酶酶切PCR擴增產物的電泳圖譜Fig.2 Electrophoregrams of 5.8S-ITS and 26S D1/D2 regions digested with different restriction endonucleases and their PCR-amplified products

2.2 Interdelta PCR指紋圖譜鑒定釀酒酵母菌

1993年，Ness等[9]提出酵母菌基因組Ty1/Ty2 反轉座子兩端存在δ序列，同時獨立的δ序列原件也存在于酵母菌中。而且δ序列在釀酒酵母的基因組中數量是最多的，分布也最廣[10]，通過擴增檢測δ序列的存在從而判斷菌株是否為釀酒酵母具有實際的應用價值。Interdelta PCR指紋圖譜法由于操作方便，擴增條帶電泳圖譜穩定等優點，在國外已經逐漸取代傳統方法，廣泛被應用于菌種鑒定中[11]。本實驗采用PCR指紋圖譜鑒定區分54株釀酒酵母，將其區分為7個亞種，所占比例分別為31.5%、11.1%、7.4%、42.6%、3.7%、1.85%和1.85%。使用Quantity One v4.62 軟件的核酸分子質量預測功能，通過人工讀帶和軟件自動讀帶相結合的方法，刪除模糊不清和強度較低的電泳條帶，預測出利用Interdelta PCR方法產生的PCR產物大致大小，Interdelta PCR指紋圖譜結果見表3，電泳圖譜如圖3所示。

表3 Interdelta PCR指紋圖譜分析結果Table 3 Results of Interdelta fingerprinting analysis of seven subspecies of Saccharomyces cerevisiae

圖3 釀酒酵母Interdelta PCR指紋圖譜分析電泳圖Fig.3 Interdelta fingerprinting patterns of Saccharomyce cerevisiae

由表3可以看出，第Ⅰ和第Ⅳ亞種的釀酒酵母數占有絕對優勢。存在于自然發酵第三期和接觸酒廠設備的葡萄汁的釀酒酵母亞種種類最多，占總類數的43%。在自然發酵第三期，類型Ⅳ的釀酒酵母菌是最多的，占該時期總菌數的82%，可以推知其在發酵過程中處于主導地位；而且在此時期，釀酒酵母的多樣性十分豐富，這也證實了葡萄酒的釀造過程就是多種菌的相互作用，而發酵過程中微生物的多樣性會豐富葡萄酒的香氣，從而提升酒的品質。

綜合以上實驗結果可知，沙城產區微生物資源豐富，將篩選得到的釀酒酵母應用于葡萄酒生產可以獲得具有獨特風味的葡萄酒。而應用分子生物學手段對釀酒酵母菌區分到亞種水平，對于選取產區優良酵母菌具有十分重要的作用。

2.3 聚類分析及結果

2.3.1 轉換0-1矩陣

將得到的所有DNA片段大小匯總，菌株電泳圖中有此條帶則為1，沒有則為0。依次將所有類型進行轉換，將結果輸入到NTSYSpc軟件下的ntedit中，保存為聚類分析文件1。

2.3.2 形系數計算

在Ntsys中用Similarity程序中的Qualitalive data，輸入上面得到的聚類分析文件1，計算形系數矩陣，輸出文件命名為聚類分析文件2。

2.3.3 生成樹圖

用Clustering中的SHAN或Njoin輸入文件2進行計算，聚類方法選擇為UPGMA，In case of ties選擇FIND，選擇的最大數要至少大于樣品數，計算輸出文件3，生成樹形圖見圖4。

圖4 釀酒酵母聚類分析樹形圖Fig.4 Cluster analysis tree of Saccharomyce cerevisiae

由圖4可知，各不同亞種的釀酒酵母菌之間的親緣關系，其中亞種第Ⅰ和第Ⅳ的親緣關系最近，而第Ⅶ與其他亞種的親緣關系最遠。在接觸酒廠設備的葡萄汁和自然發酵第三期獲得的釀酒酵母菌的相似性很高。滅菌的發酵罐或者剛建的新酒廠設備表面是沒有釀酒酵母存在的，設備上的釀酒酵母菌是在進行了發酵之后殘留在設備外表面上的，因此設備表面的釀酒酵母菌種類和發酵過程中處于主導的釀酒酵母菌極為相似，且在篩選得到的釀酒酵母菌中數量上也處于主要地位。

3 結 論

釀酒酵母菌株的獲得是在自然發酵第三和第四期、葡萄酒廠生產的自流汁、接觸酒廠設備的葡萄汁中。而葡萄園土壤中釀酒酵母存在的數量很少，不容易獲得。利用Interdelta PCR指紋圖譜法能夠較快速準確的將釀酒酵母菌在亞種水平上進行區分，通過聚類分析可以得到這些不同亞種釀酒酵母菌的親緣關系，使其更加接近于自然分類系統。通過分析可以看出，葡萄酒的發酵過程是需要多種酵母菌參加反應的，酵母菌種的混合發酵有利于酒的品質和風味的提高，而在發酵過程中產生最重要作用的釀酒酵母菌存在于發酵的第三和第四期。進一步的研究是將區分到亞種水平的釀酒酵母菌進行生理生化特性研究和發酵性能測試，從而篩選出適合于發酵生產用的菌株，對于豐富葡萄酒風味，釀造具有地區特色的葡萄酒產品具有現實的指導意義。

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Interdelta PCR Fingerprinting for the Identification of Saccharomyce cerevisiae from Shacheng Area

ZHAO Jing-jing1，LI Yan1,2,*，ZHANG Li-zhong3，ZHUANG Yu-ting1
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China；3. China Great Wall Wine Co. Ltd., Shacheng 075400, China)

Interdelta PCR fingerprinting technology was used to differentiate 54 Saccharomyce cerevisiae strains isolated from vineyard soil, brewing equipments and spontaneous fermentation process of Longan grape in Shacheng area. Results indicated that 7 genetic patterns were distinguished by Interdelta PCR fingerprinting. The genetic patterns I through VII accounted for 31.5%, 11.1%, 7.4%, 42.6%, 3.7%, 1.85% and 1.85%, respectively. The numbers of genotypes of yeasts isolated the late stage of spontaneous fermentation, the surface of brewing equipments and vineyard soil were 4, 3 and 2, respectively. Based on the cluster analysis tree, the genetic pattern I and IV had the closest genetic relationship, and the genetic pattern VII had the most far genetic relationship with others. The distribution and variation discipline of different Saccharomyce cerevisiae strains will provide a theoretical foundation for choosing excellent strains with their own favor characteristics.

Saccharomyce cerevisiae；Interdelta PCR；differentiation and identification；cluster analysis；Shacheng area； Longan grape

Q93.331

A

1002-6630(2010)23-0281-04

2010-07-06

河北省2009年科技支撐計劃課題項目(092210003D)

趙靜靜(1985—)，女，碩士研究生，主要傳統發酵工程創新技術研究。E-mail：ly5885@yahoo.com.cn

李艷(1958—)，女，教授，主要從事傳統發酵工程創新技術研究。E-mail：lymdh5885@163.com