Neurospora.crassa降解茶粕培養基粗纖維的發酵工藝研究

肖玉娟，鄧澤元*，范亞葦，李 靜，劉 蓉，胡蔣寧

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，高等研究院，江西 南昌 330047)

Neurospora.crassa降解茶粕培養基粗纖維的發酵工藝研究

肖玉娟，鄧澤元*，范亞葦，李 靜，劉 蓉，胡蔣寧

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，高等研究院，江西 南昌 330047)

以提取茶皂素后的茶粕為材料，研究Neurospora.crassa(粗壯脈紋胞菌)降解茶粕培養基粗纖維的發酵條件。在單因素試驗的基礎上，選定豆渣、米糠、含水量及發酵時間進行四因素三水平Box-Behnken實驗，建立粗纖維降解率的二次回歸方程，通過響應面分析得到優化組合工藝條件。結果表明：最佳的茶粕發酵條件為豆渣添加量29.38%、米糠添加量18.54%、含水量72%、發酵時間74.9h時，培養基粗纖維降解率達到最大值。該條件下粗纖維降解率預測值為48.65%，驗證值為48.36%。

粗壯脈紋胞菌；茶粕；發酵條件；響應曲面法優化

茶粕，又稱茶籽餅、茶麩、茶枯，呈紫褐色顆粒，是山茶科植物的果實榨油后剩下的渣，其中油茶茶籽粕和茶葉茶籽粕產量較大，其年均總產量約70萬t，是潛在的可利用茶粕資源[1]。目前，茶籽主要采用傳統的壓榨法榨油工藝制油, 所生產的茶粕中茶皂素、單寧等抗營養因子含量過高，不適宜直接用于動物飼料生產，大部分被用作清塘劑、肥料、燃料，少量用于茶皂素的提取，極少部分用于飼料資源的開發應用[2]。茶粕如果去除了有毒物質茶皂素，其營養價值可與米糠媲美，且經過微生物發酵后，可得到較高的菌體蛋白，提高了茶粕的利用價值[3]。因此，本實驗采用提取茶皂素(本課題組的專利技術)后的茶粕為主要原料，利用實驗室自行篩選的一株產纖維素酶能力較強的粗壯脈紋孢菌(Neurospora.crassa)降解茶粕培養基粗纖維，以期在茶粕的動物飼料開發利用方面提供一種更為有效的途徑。

響應面分析(response surface methodology) 法是采用多元二次回歸方法作為函數估計的工具[4]，將實驗中多因素與指標的相互關系作近似擬合，可同時對影響生物產量的各因素水平及其交互作用進行評價與優化[5]。因此它能快速有效地確定多因子系統中的最優條件，該法已經廣泛應用于各種培養基及發酵條件的優化[6]。本實驗在單因素試驗的基礎上，選出對粗壯脈紋孢菌降解茶粕培養基粗纖維具有顯著作用的4個因素的3個水平進行Box-Behnken試驗，通過響應面分析確定其最佳值、優化工藝參數。

1 材料與方法

1.1 菌種

粗壯脈紋孢菌(Neurospora.crassa)由本實驗室篩選保存。

1.2 儀器與設備

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、移液器、恒溫恒濕培養箱、電子天平、干燥箱、廣口瓶、調溫電熱套等。

1.3 培養基

斜面固體培養基：2%蛋白胨、 4%麥芽糖、1.5%～1.8%瓊脂，pH5.5～6.0。

種子液培養基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、 MgSO4·7H2O 0.5g、KH2PO41g、pH值自然，蒸餾水定容到1 L。

1.4 方法

1.4.1 種子培養

從新鮮菌體活化培養基上取1環菌接入種子液培養基(30mL/250mL錐形瓶)，于30℃、160r/min搖瓶培養3 6 h，備用。

1.4.2 發酵方法

在茶粕培養基中配入相應比例的豆渣和米糠，裝入200mL的廣口瓶中，料層厚度控制在3～4cm，按不同的料水比加入水攪勻，高壓滅菌。接入5mL/100g的種子液于固體培養基中，將廣口瓶置于恒溫恒濕箱中，在溫度為30℃，濕度為70%的條件下進行好氧發酵[7]。

1.4.3 含水量的測定

茶粕培養基中配入豆渣和米糠后，加水浸潤，置于廣口瓶中，并用紗布和報紙蓋上，放入高壓滅菌鍋后，121℃滅菌30min。滅菌后的培養基105℃烘干至質量恒定[8]，含水量的計算公式如下：

式中：m1為滅菌后培養基的質量；m2為干燥后培養基的質量。

1.4.4 粗纖維的含量測定及降解率的計算

茶粕固態發酵樣品粉碎過篩孔尺寸為0.425mm的篩子，混勻后先用煮沸的體積分數為1.25%的稀硫酸處理，以去除其中的糖、淀粉、果膠等酸溶性物質，再用煮沸的體積分數為1.25%的氫氧化鈉溶液處理，以除去蛋白、脂肪等堿溶性物質。最后用95%乙醇和無水乙醚處理除去單寧、色素以及殘余的脂肪，105℃烘干后所得殘渣即為粗纖維[9]。

式中：m1為培養基發酵前粗纖維總質量/g；m2為培養基發酵后粗纖維總質量/g。

1.5 粗壯脈紋胞菌降解茶粕培養基粗纖維的發酵條件優化

1.5.1 單因素對茶粕培養基粗纖維降解率的影響

影響粗壯脈紋胞菌生長及粗纖維降解率的因素很多[10]，如添加的豆渣比例、米糠比例、培養基含水量、初始pH值及發酵時間等。根據相關文獻報道[11-12]，選用豆渣10%、米糠20%、初始pH值自然、含水量68%、發酵時間72h為基本參數。確定一項最優條件后，后續試驗均按前面的優化值來進行試驗。

1.5.2 Box-Benhnken中心組合試驗

在單因素試驗的基礎上，確定影響粗壯脈紋胞菌降解茶粕培養基粗纖維的顯著因素，采用Box-Benhnken試驗設計進行發酵條件優化[13]。得到的數據采用SAS 8.2軟件進行統計分析，當P＜0.05時為顯著性水平。

1.5.3 驗證實驗

將優化實驗所得的數據與響應面模型進行回歸擬合，確定其極值點及其相應自變量的取值，并進行驗證實驗及可靠性分析。重復3次，用平均值進行驗證比較。

2 結果與分析

2.1 茶粕發酵過程中單因素對粗纖維降解率的影響

2.1.1 豆渣比例對粗纖維降解率的影響

圖1 豆渣比例對粗纖維降解率的影響Fig.1 Effect of soybean residue on the degradation rate of crude fiber

如圖1所示，粗纖維降解率隨豆渣比例的增加而呈上升趨勢，當向培養基中添加20%以上的豆渣時，粗纖維的降解率增幅減小，上升緩慢。為了多利用茶粕，故選擇豆渣比例為20%。

2.1.2 米糠比例對粗纖維降解率的影響

如圖2所示，粗纖維降解率隨米糠比例的增加，呈現先上升再下降的總體趨勢，在添加量為20%附近出現最大值。

圖2 米糠比例對粗纖維降解率的影響Fig.2 Effect of rice bran on the degradation rate of crude fiber

2.1.3 初始pH值對粗纖維降解率的影響

如圖3所示，培養基的pH值會影響微生物的生長和酶的穩定性，粗纖維降解率在初始pH6.0左右達到最大值，此后隨著pH值上升而逐漸降低，特別是pH值為8.0時，粗纖維降解率顯著降低。由于培養基的自然pH值在5～6之間，故選擇自然pH值發酵。

2.1.4 含水量對粗纖維降解率的影響

圖4 含水量對粗纖維降解率的影響Fig.4 Effect of water content on the degradation rate of crude fiber

如圖4所示，粗纖維降解率隨培養基含水量的增加，呈現先上升再下降的趨勢，且增減幅度明顯，在含水量為70%附近達到最大值。初步確定含水量在70%時發酵效果最佳。

2.1.5 發酵時間對粗纖維降解率的影響

圖5 發酵時間對粗纖維降解率的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the degradation rate of crude fiber

如圖5所示，發酵時間是影響發酵產物中粗纖維含量的一個重要參數[14]，主要取決于微生物的生長和代謝速率，還取決于基質中的營養成分及內部環境[15]。發酵時間太短，微生物不能充分利用碳源來生長，達不到理想的粗纖維降解效果；發酵時間太長，則生產周期變大，生產成本變高，而且容易滋生雜菌。在發酵初期，隨著發酵時間的延長，產品中粗纖維的含量逐漸減少，當發酵時間為72h后，產品的粗纖維降解率增幅很低，故選用發酵時間72h左右為宜。

2.2 響應面分析法優化粗纖維降解率工藝條件

根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗所得結果，確定發酵pH值為自然，選取豆渣比例、米糠比例、含水量和發酵時間4個對粗纖維降解率影響顯著的因素，分別以X1、X2、X3和X4代表，每一個自變量的低、中、高試驗水平分別以－1、0、1進行編碼(表1)。以茶粕培養基粗纖維降解率為響應值(Y)，在單因素試驗的基礎上采用四因素三水平的響應面分析方法，試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

對豆渣比例X1、米糠比例X2、含水量X3和發酵時間X4作變換如下：X1=(A－20)/10，X2=(B－20)/10，X3=(C－70)/10，X4=(D－72)/12。以X1、X2、X3和X4為自變量， 以3次試驗所得粗纖維降解率的平均值為響應值(Y)，得到結果見表2，其中1～24是析因試驗，25～27是中心試驗，用來估計實驗誤差。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface analysis

從表3的回歸分析結果可以看出，用上述的回歸模型描述各因素與響應值之間的關系時，模型4個因素的P值均小于0.01，失擬項P=0.080434＞0.05，表明該模型顯著；回歸方程的相關系數R2=0.9662，表明該模型與實際實驗擬合較好，因此該模型可用于該菌對茶粕培養基粗纖維降解的分析和預測。回歸方程各項的方差分析結果還表明，自變量(豆渣比例、米糠比例、含水量和發酵時間)與響應值(粗纖維降解率)之間線性關系極顯著(P＜0.01)；含水量對粗纖維降解率的曲面效應極顯著；豆渣比例與米糠比例、豆渣比例與含水量的交互作用也極顯著；而X12、X22、X42、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4的作用不顯著。

表3 響應面試驗回歸分析結果Table 3 Results of regression analysis

對茶粕培養基粗纖維降解率模型進行求導和解逆矩陣可以得到模型的極值點，豆渣為29.38%、米糠為18.54%、含水量為72%、發酵時間74.9h時，此時模型預測的最大響應值為48.65%。

2.3 驗證實驗

為了檢驗模型預測的準確性，在上述響應面分析得到的最優化條件和原始菌體生長條件下進行發酵實驗，重復3次實驗所得茶粕培養基粗纖維的降解率為48.36%，與模型預測的最佳值基本吻合。說明響應面法優化得到的發酵條件參數準確可靠。

3 討 論

3.1 培養基一定的載氧能力有利于粗壯脈紋胞菌的生長

單因素試驗表明粗纖維降解率隨豆渣比例的增加而呈上升趨勢，當培養基中豆渣比例超過20%時，粗纖維的降解率增幅減小，上升緩慢；同樣粗纖維降解率隨米糠比例的增加，呈現先上升再下降的趨勢，在米糠比例20%附近出現最大值。響應面優化得到豆渣為29.38%、米糠為18.54%時，粗壯脈紋胞菌生長好、粗纖維降解率最大。粗壯脈紋胞菌為需氧菌，培養基一定的載氧能力有利于該菌的生長和發育；而豆渣富含淀粉和纖維、米糠也富含纖維，他們的添加可以改善培養基的載氧能力，因此蓬松的原料有利于該菌的生長。在固態發酵中，適宜的發酵含水量，使得基質顆粒之間膨松有空隙，疏松度合適，有助于菌體從中獲得營養及氧氣的傳遞。但是過高的含水量會導致基質黏結成團，通氣性下降，影響氧的傳遞，導致酶活下降；而含水量過低，水的活度下降，不利于物質傳遞，從而抑制粗壯脈紋胞菌對粗纖維的降解過程。

3.2 茶粕通過粗壯脈紋胞菌發酵是一種較好的飼料資源

我國可利用的茶粕資源十分豐富，但目前對茶粕的研究報道，大多專注于活性物質茶皂素的提取，而把茶粕發酵成飼料的報道較少。通過脫茶皂素加工工藝生產的茶粕是一種良好的飼料原料。它含有多種對動物生長發育有利的必需微量元素，其中Mg、Ca、Fe、Zn、K、Cu的含量分別為：2730、1230、268.4、29.7、14790、17.28mg/kg；而據劉彥明等[16]的研究報道，茶粕中的有害元素Pb、Cd 的含量卻很低或近于零。經粗壯脈紋胞菌發酵生產的茶粕發酵產品，粗纖維含量降低，從初始的21.52%降至14.15%，部分纖維素和木質素成為了易消化的單糖或對腸道細菌有益生作用的低聚糖，經檢測，可溶性糖含量由初始的7.6%提高至35.97%。發酵后的粗蛋白含量提高，從初始的12.82%提高至18.34%，茶粕中的非蛋白氮轉化為菌體真蛋白，產品的營養價值得到較大的提升。另外，粗壯脈紋胞菌是一株產β-胡蘿卜素能力較強的菌，其發酵后培養基中β-胡蘿卜素含量可達100mg/kg以上，這使茶粕發酵產品同時有望成為一種良好的蛋禽天然色素飼料。總之，在動物生產中科學合理地使用茶粕發酵產品有利于緩解我國飼料資源緊缺的局面。

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Fermentation Processing of Fiber Degradation from Oil-tea-cake Residue byNeurospora. crassa

XIAO Yu-juan，DENG Ze-yuan*，FAN Ya-wei，LI Jing，LIU Rong，HU Jiang-ning

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Institute for Advanced Study, Nanchang University,Nanchang 330047, China)

The fermentation processing for fiber degradation from the residue of oil-tea-cake after the extraction of tea saponin was investigated. According to results of single-factor experiments, soybean residue, rice bran, water content and fermentation time were selected for the Box-Behnken design to establish a quadric regression equation for describing the degradation of fiber.The optimal fermentation conditions were achieved by response surface analysis to be soybean residue of 29.38%, rice bran of 18.54%, water content of 72% and fermentation time of 74.9 h. Under the optimal fermentation conditions, the highest degradation of fiber reached up to 48.65%, which was consistent with 48.36% of the validated value.

Neurospora. crassa；oil-tea-cake；fermentation processing；response surface methodology

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0243-05

2010-07-23

2010年江西省科技重大專項；食品科學與技術國家重點實驗室目標導向課題(SKLF-MB-201003)

肖玉娟(1986—)，女，碩士研究生，主要從事發酵工程研究。E-mail：xiaoyujuan0520@163.com

*通信作者：鄧澤元(1963—)，男，教授，博士，主要從事脂肪酸及天然產物研究。E-mail：dengzy28@yahoo.com.cn