耐受性黃酒酵母YS6.2.5的選育及初步應用

夏艷秋，朱 強，汪志君，路 琦

(1.淮海工學院海洋學院，江蘇 連云港 222005；2.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225001)

耐受性黃酒酵母YS6.2.5的選育及初步應用

夏艷秋1，朱 強1，汪志君2，路 琦1

(1.淮海工學院海洋學院，江蘇 連云港 222005；2.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225001)

黃酒酵母的耐受性對黃酒釀造至關重要。對原始菌株YS分別采用乙醇-熱沖擊法、細胞紫外誘變法和原生質體紫外誘變法，結合高溫馴育進行選育，篩選到一株在38℃能正常生長發酵的黃酒酵母突變株YS6.2.5。YS6.2.5體積小，近似圓形，產香好，產酸少，30℃時產酒精能力、酒精耐性、高糖耐性分別為9.0%、19%、30°Bx，38℃時相應指標分別為6.5%、20%、28°Bx。釀酒實驗表明，其生理耐性強，釀酒性能好，遺傳性狀穩定，具有較好的工業應用前景。

黃酒酵母；耐受性；誘變育種；熱效應；原生質體

黃酒是我國的特有酒種，是國家提倡發展的低度、營養、保健的發酵原酒，已成為時尚新寵。黃酒發酵是典型的半固態雙邊發酵，醪液濃度高、溫度高、酒精度高是新工藝黃酒采用大罐深層純種發酵的最大特點。一般的釀酒酵母最適生長發酵溫度為25～28℃，耐酒精體積分數12%左右，20%以上的糖或鹽所形成的滲透壓便會對酵母生長產生抑制作用[1]。而黃酒發酵品溫最高達40～42℃，糖分可高達40%以上，酒精體積分數為15%～20%，加上發酵后期養分不足等多種脅迫條件，極易導致酵母菌早衰、死亡，進而使糖化發酵雙邊失衡，卻強化了雜菌的增殖，這是黃酒酸罐事故頻發的主要原因，夏季尤為嚴重。因此，選育生理耐性強的黃酒酵母，尤其是耐高溫黃酒酵母是黃酒業當務之急。然而，比起葡萄酒和清酒[2-4]，黃酒行業極少開展酵母菌耐受性的研究工作[5-6]，且停留在根據酵母菌的發酵情況和酒的風味篩選理想菌株，即“自然育種”階段[7-8]，目前尚未見誘變選育耐受性黃酒酵母的報道。鑒于此，本實驗擬采用紫外誘變和熱效應等方法選育耐受性黃酒酵母，并初步研究其在黃酒釀造中的應用，旨在獲取新型優良黃酒酵母以提高黃酒產量和質量，并為進一步推動對現行黃酒工藝體系的技術升級和改造提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

黃酒酵母(S. cerevisiae)YS由丹陽黃酒廠饋贈，揚州大學食品科學與工程學院微生物實驗室保藏。

1.2 溶液與培養基

高滲緩沖液PBS：0.2mol/L磷酸鹽緩沖液內含0.7mol/L KCl，pH5.8；脫壁酶液：2%蝸牛酶-PBS溶液(微孔濾膜過濾除菌)。

斜面培養基：麥芽汁培養基；完全培養基：YPD培養基；高滲再生培養基YPDP：于YPD中添加0.7mol/L KCl、50mmol/L CaCl2、20mmol/L MgSO4·7H2O、瓊脂(上層1.5%，下層2%)；初篩培養基：TTC雙層培養基；復篩培養基：大米糖化液。

除脫壁酶液外，以上溶液與培養基殺菌條件均為121℃、濕熱滅菌15min。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌單細胞懸浮液(YSS)制備

接種已活化的酵母菌于麥芽汁培養基中，30℃、200r/min恒溫搖床培養至對數期，3000r/min離心5min，所得沉淀即為酵母菌細胞，用生理鹽水洗滌兩次，并稀釋成1.0×107cells/mL。

1.3.2 乙醇-熱沖擊處理

取5mL YSS，先在低體積分數乙醇中低溫保持一段時間，然后在高體積分數乙醇高溫下保持一段時間，梯度稀釋后涂布TTC下層平板，38℃培養2～3d，傾倒TTC上層培養基，避光于30℃保溫2～3h，挑取單菌落。

1.3.3 細胞紫外誘變及高溫處理

取5mLYSS，置15W紫外燈下28cm處振蕩照射不同時間，梯度稀釋后涂布TTC下層平板，分別置30、34、38、42、45℃避光培養2～3d，傾倒TTC上層培養基，避光于30℃保溫2～3h，挑取單菌落。

1.3.4 酵母菌原生質體制備與再生[9]

取5mL YSS，加5mL PBS，28℃保溫5min，3000r/min離心10min，所得沉淀用PBS洗滌2次；加5mL脫壁酶液，28℃、150r/min水浴振蕩保溫100min左右；定時取樣鏡檢，當90%左右的細胞轉變為原生質體時，先1000r/min離心5min，使酵母細胞壁碎片沉淀，取上層混濁液3000r/min離心10min，所得沉淀即為原生質體，用PBS洗滌2次，梯度稀釋后涂布YPDP平板，30℃培養2～3d即可再生出細胞壁。

式中：A為酶處理前細胞數；B為酶處理后未脫壁細胞數；C為酶處理后未脫壁的細胞數和原生質體再生細胞數的和。

1.3.5 原生質體紫外誘變[9]及高溫馴育

將所得原生質體用PBS稀釋成1.0×107cells/mL，置15W紫外燈下28cm處振蕩、照射不同時間，用PBS梯度稀釋后涂布YPDP平板，38℃避光培養2～3d，轉移至TTC下層平板，然后在連續提高溫度的條件下培養，傾倒TTC上層培養基，避光于30℃保溫2～3h，挑取單菌落。

1.3.6 酵母菌發酵力實驗

大米加水4～5倍煮成粥狀，冷卻至60℃，加入15%～20%的麩曲或麥曲，60℃保溫糖化5h，糖化完畢(碘液實驗不變色)過濾，調整濾液糖度，用乳酸調整pH3.9～4.1，備用。

500mL三角瓶中裝200mL經稀釋的大米糖化液，接種(接種量2.0×107cells/mL)，30℃或38℃靜置培養5d，每隔24h振蕩0.5h，測定發酵結束醪液理化指標。

1.3.7 酵母菌酒精耐性(或高糖耐性) 實驗

用無水乙醇(或水)調整如1.3.6節糖化液中酒精體積分數(或糖分濃度)，裝上發酵栓，每隔24h振蕩稱質量，至失質量小于0.2g，停止培養，綜合酵母菌生長與總失質量等指標表征其酒精耐性(或高糖耐性)。

1.3.8 黃酒發酵工藝流程

原料大米→洗米→浸漬→蒸飯→淋飯→拌曲、接種酵母菌→發酵→后處理→干黃酒

1.4 分析方法

酵母菌細胞計數、形態、大小和生長曲線的測定參照文獻[9]。黃酒理化指標的測定參照黃酒GB/T 13662—2 0 0 8《黃酒》。

2 結果與分析

2.1 乙醇-熱沖擊誘變結果

表1 乙醇-熱沖擊處理誘變結果Table 1 Mutation results of Saccharomyces cerevisiae by ethanol-heatshock

表1表明，單一熱效應只能引起極少數酵母細胞變異或死亡，且正突變率較低，誘變效果不理想，而熱和其他誘變因子的復合誘變則可以發揮各自的優點，從而取長補短，進而達到比較滿意的結果。如先低溫低酒精體積分數短時間、后高溫高酒精體積分數長時間乙醇-熱沖擊處理的酵母菌存活率(14.17%)較適宜，且細胞萌發早、生長快，TTC染色顯紅色，表現出較好的酒精發酵能力、高溫耐受性及酒精耐受性。而直接高溫高酒精體積分數沖擊處理，即使短時間也容易造成大量酵母菌死亡，且殘存的極少數酵母菌由于受到強烈沖擊，其發酵性能幾乎全部喪失，TTC染色不顯色?？梢姡词共捎脧秃险T變也以梯度處理為宜。根據TTC顯色深淺可判斷酵母菌產酒精能力的高低[10]：發酵能力強的酵母菌顯紅色，次之顯粉紅色、微紅色，發酵能力極弱不顯色。原始菌株YS經乙醇-熱沖擊處理，挑選48株在38℃生長發酵性能較好的菌株接種斜面培養基培養，搖瓶復篩所得6株較優突變株性狀如表2所示。

表2 乙醇-熱沖擊處理后6株突變株性狀Table 2 Properties of 6 mutants through ethanol-heat-shock

由表2可知，6株突變株在30℃時的各項理化指標均較接近，而38℃時則表現出較大差異，尤其是YS6發酵力最高，耐酒精體積分數為18%，且細胞大小合適，產酸適中，產香好。因此，挑取Y S 6為紫外誘變出發菌株，進一步提高其生理耐性。

2.2 紫外誘變、高溫培養篩選結果

2.2.1 細胞紫外誘變結合高溫培養

圖1 YS6菌株細胞紫外誘變致死曲線Fig.1 Lethal curve of YS6 cells induced by UV

圖1表明，YS6菌株細胞對紫外光非常敏感，隨照射時間延長，其致死率呈快速上升趨勢。鑒于致死率為75%～85%甚至更低時，正變率較高，產量提高的潛力也更大[11]，確定UV照射2min(致死率為82.15%)為YS6最適紫外誘變劑量。將不同照射劑量的酵母菌涂布TTC下層平板，培養結果見表3。

表3 YS6細胞紫外誘變后在不同培養溫度下酵母菌生長結果Table 3 Yeast growth of YS6 cells induced by UV at different temperatures

熱影響微生物細胞酶的活性，進而影響突變后細胞的修復過程，因而，在適宜的溫度條件下培養經其他誘變因子誘變后的細胞，可望提高誘變的正變率并可定向選育耐高溫/低溫突變株[12]。表3表明，當培養溫度高于38℃時，菌體蛋白變性，酶失活，酵母菌幾乎全部死亡；低于38℃時，酵母菌仍能生長，但照射劑量過低誘變效果差，而照射劑量過高則導致部分酵母菌的發酵能力降低甚至喪失。UV照射2.0min、38℃培養時，酵母菌生長良好，誘變效果最好，證實了圖1中紫外誘變劑量的可靠性。挑取照射2.0min、38℃培養的突變株60株，搖瓶復篩所得優良突變株YS6.2性狀見表4，并以其為原生質體紫外誘變出發菌株。

2.2.2 原生質體紫外誘變結合高溫馴育

預實驗確定制備YS6.2原生質體的基本條件為：培養至對數生長早期，酶解溫度為30℃，最適pH5.8，由于采用EDTA和β-巰基乙醇前處理后再生率下降了42.07%，故不需前處理。

圖2 YS6.2原生質體形成與再生曲線Fig.2 Formation and regeneration of YS6.2 protoplast

圖2表明，隨著酶解時間的延長，原生質體形成率快速增加，而再生率急劇下降。酶解80min時，原生質體形成率為90.47%，再生率達13.45%，酶解120min時，原生質體形成率為99.99%，再生率只有0.75%，比酶解80min時下降94.42%。資料顯示[9]，原生質體制備時，殘留的少量細胞壁就像結晶時的“晶種”，可以提高原生質體再生率。可見再生率與原生質體的制備過程及原生質體形成率都有很大關系，本實驗的目的是去除酵母菌細胞壁對紫外線的阻礙作用，再生率過低不利于誘變選育優良菌株，所以采取80min為最適酶解時間。其紫外誘變致死曲線見圖3。

圖3 YS6.2原生質體紫外誘變致死曲線Fig.3 Lethal curve of YS6.2 protoplast induced by UV

圖3表明，YS6.2原生質體對紫外光的敏感度比完整細胞強，照射30s時，致死率為73.76%。因此，確定紫外照射30s為YS6.2原生質體最適紫外誘變劑量。

于再生完全培養基平板上，挑選38℃生長較慢、菌落形態好、TTC顯紅色的再生酵母菌56株，搖瓶復篩得8株發酵力強、產酸少、產香好的菌株。將這8株菌從33℃到38℃連續提高培養溫度 (3代/梯度)，結合搖瓶復篩，最終篩選出優良突變株YS6.2.5，其能在38℃正常生長發酵，性狀見表4。

由表4可知，經紫外誘變結合熱篩選，30、38℃時菌株的各項生理指標都有明顯改善。與原始菌株YS相比，突變株YS6.2.5產酒精體積分數分別提高32.35%和116.67%，耐酒精體積分數分別提高到19%和20%，產酸大大降低。另外，YS6.2.5形體變小、近似圓形，這樣更適于釀酒，因為較小的細胞有較大的比表面積，可以增加單位菌體的產酒量，縮短發酵時間，凝聚性也好，近幾年人們傾向于選育這種中小型的優良釀酒酵母。2.3 突變株YS6.2.5遺傳穩定性

表5 傳代培養對YS6.2.5性狀的影響Table 5 Effect of passage on YS6.2.5 properties

突變株YS6.2.5于麥芽汁斜面培養基連續傳代、發酵培養，性狀見表5。

表5表明，突變株YS6.2.5連續傳代培養15代，無論在30℃還是在38℃性狀未見明顯改變，說明其遺傳性狀是穩定的。

2.4 突變株YS6.2.5糖耐性

圖4 糖度對酵母菌生長與發酵的影響Fig.4 Effect of sugar concentration on the growth and fermentation of yeast

由圖4可知，隨著發酵液糖度的提高，酵母菌生長與發酵的能力均呈先增強后降低趨勢。其中，30℃時，突變株YS6.2.5的細胞數和產CO2量分別于28°Bx和30°Bx達到峰值，比原始菌株YS均提高了2～4°Bx，且YS6.2.5發酵各指標在達到峰值后下降幅度遠小于YS。38℃時，YS6.2.5的細胞數和產CO2量均于28°Bx達到峰值，僅比30℃時其各指標峰值糖度降低0～2°Bx，且各指標在相同糖度的降低比例均小于50%。在較高的糖度條件下，38℃時YS6.2.5發酵各指標明顯高于30℃時YS相應指標。以上分析表明，突變株YS6.2.5具有較強的高糖耐性和高溫耐性，從而保證黃酒夏季安全生產。

2.5 突變株YS6.2.5用于黃酒釀造

由表6可知，即使在黃酒主發酵品溫高達35℃以上時，突變株YS6.2.5仍保持旺盛的生命活力，至后酵結束，細胞數仍有1.0×107cells/mL，死亡率低于0.2%，節省約40%冷耗，發酵周期也大大縮短。且其成品酒酒精體積分數高、殘糖低，氨基酸總量高，原料利用充分，酒體柔和清爽，較具典型性。值得注意的是，YS6.2.5成品酒中Arg含量較低。Arg在酵母菌生長發酵過程中可由菌體內精氨酸酶轉化為尿素，尿素則進一步與乙醇生成有致癌作用的氨基甲酸乙酯(EC)[13]。國際標

表4 選育過程中菌株性狀變化Table 4 Change in properties of strains during breeding

表6 YS6.2.5與YS成品黃酒理化指標比較

Table 6 Comparison of physico-chemical properties of rice wine products fermented by YS6.2.5 and YS準規定飲料酒中EC的含量不得超過30μg/L。通過選育不產或少產Arg(或尿素)的酵母菌則可以從根本上解除黃酒中EC的危害。另外，較少的Val可減少雜醇油的形成，并減輕酒的苦澀味。

菌株 酒精體積分數/% 總糖含量/(g/L)總酸含量/(g/L)氨基氮含量/(g/L)揮發酸含量/(g/L)揮發酯含量/(g/L)雜醇油含量/(g/L) 風格YS6.2.5 14.6 2.13 4.13 0.844 0.065 0.392 0.189 柔和清爽YS 13.1 3.68 4.97 0.785 0.127 0.313 0.468 醇厚稍澀菌株 Thr含量/(g/L) Val含量/(g/L) Leu含量/(g/L) Ile含量/(g/L) Phe含量/(g/L) Trp含量/(g/L) Lys含量/(g/L)Arg含量/(g/L)YS6.2.5 0.653 0.175 0.287 0.149 0.217 0.031 0.130 0.021 YS 0.605 0.240 0.259 0.125 0.242 0.029 0.125 0.367

3 討 論

在全球水資源高度緊張的今天，選育和應用耐高溫酵母已成為當前國內外研究的熱門課題之一[14-15]。耐高溫酵母具有生長速度快、生產效率高、耐受性能好、不易污染雜菌等優點，可節能降耗，對于脅迫條件多且復雜的黃酒發酵尤為重要。

脅迫處理能夠引起菌體細胞質膜發生變異，并產生對應的脅迫抗性，這種保護機制被稱為沖擊應力，包括熱激蛋白及海藻糖等，一旦細胞合成了這些應力，細胞便可以適應這些極端環境得以生存下去。Sanchez等[16]指出，酵母菌通過熱和乙醇沖擊均能產生熱激蛋白。Watson等[17]則指出：熱沖擊在提高酵母菌耐熱性的同時，亦可提高其酒精耐性及滲透壓耐性等，將會獲得具多重生理耐性的酵母菌。本實驗采用乙醇-熱沖擊選育的YS6菌株，38℃發酵5d產酒精體積分數為5.5%，酒精耐性由14%提高到18%，為下一步選育工作奠定了良好基礎。

在微生物的誘變育種工作中，熱不僅具有誘變效應，而且在其他誘變劑誘變處理后可作為篩選條件，利用突變的多向性及篩選的定向性實現“定向”誘變育種，可提高誘變正突變率和篩選效率[12,15]。比起需要專用設備的其他物理誘變方法和多是劇毒藥品的化學誘變方法，熱誘變方法不僅設備簡單、操作方便安全，而且熱效應明顯，可控性好，遺傳穩定，必將受到科研工作者的廣泛重視。

原生質體技術是一種新興的育種方法，其中原生質體融合育種作為一種非特異基因重組技術倍受青睞，但在原生質體融合之前，需先對親本加上多個遺傳標記，此項工作費時費力，且影響菌體活力和一些有用的性狀。而對原生質體直接進行誘變處理，方法簡便，由于其易發生突變的位點裸露在外，因此對誘變劑更為敏感，正突變率更高且變異幅度也更大[18]。本實驗采用紫外誘變結合熱效應選育的耐受性黃酒酵母YS6.2.5經發酵驗證，性狀優良，遺傳穩定。

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Breeding and Application of Tolerant Chinese Rice Wine Yeast YS6.2.5

XIA Yan-qiu1，ZHU Qiang1，WANG Zhi-jun2，LU Qi1
(1. School of Ocean, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225001, China)

Tolerance of rice wine yeast is essential for brewing rice wine. In order to breed tolerant rice wine yeast, original yeast strain YS (Saccharomyces cerevisiae) was subjected to ethanol-heat-shock, UV-induced mutagenesis of cells and proptoplasts coupled with high temperature domestication to screen and obtain a mutant yeast YS6.2.5 with normal growth at 30 ℃ for rice wine fermentation. The mutant YS6.2.5 had the characteristics of small size, round shape, good aroma-producing favor and low acid-producing property. The alcohol-producing capability, alcohol tolerance, sugar tolerance of YS6.2.5 were 9.0%, 19% and 30 °Bx at 30 ℃, and 6.5%, 20% and 28 °Bx at 38 ℃, respectively. Fermentation tests showed that the YS6.2.5 had strong physiological tolerance, high fermentation power, stable hereditary, and better industrial application prospect.

rice wine yeast；tolerance；mutagenesis breeding；thermal effect；protoplast

Q936

A

1002-6630(2010)23-0228-05

2010-01-25

夏艷秋(1977—)，女，講師，碩士，主要從事發酵工程及酶技術研究。 E-mail：xyq78412@163.com