白背毛木耳菌絲體深層發酵工藝優化

冀 宏，李 智，鄭麗雪

(常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500)

白背毛木耳菌絲體深層發酵工藝優化

冀 宏，李 智，鄭麗雪

(常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500)

以菌絲體干質量濃度為考察指標，對白背毛木耳液體深層發酵的培養基及工藝條件進行優化。通過正交試驗(L9(34))確定了發酵培養基最佳配方。在此基礎上，基于三因素三水平的Box-Behnken設計試驗，采用響應曲面分析法對影響白背毛木耳菌絲體生長的發酵溫度、搖瓶轉速和發酵時間進行優化，確定最佳的培養條件。結果表明白背毛木耳深層發酵的最佳培養基組分為：葡萄糖2.00g/100mL、酵母膏0.20g/100mL、磷酸二氫鉀0.25g/100mL、硫酸鎂0.15g/100mL，當發酵溫度為26℃、轉速為182r/min、發酵時間為6.07d(145.7h)時發酵菌絲體干質量濃度最高，可達1.93g/100mL，較優化前提高了1.24倍。

白背毛木耳；深層發酵；菌絲體干質量；正交試驗；響應曲面法

白背毛木耳(Auricularia polytricha) 隸屬于擔子菌亞門，層菌綱，木耳目，木耳科，木耳屬中的毛木耳種[1]。按照背部絨毛層顏色不同，毛木耳分為白背毛木耳和黃背毛木耳兩個商業化栽培品種[2]。白背毛木耳于20世紀末由臺灣省引進，是國際市場需求的主要毛木耳品種。

食用菌深層發酵具有時間短、效率高、成本低等優勢[3-4]。對毛木耳深層液體發酵技術的研究及其發酵產物的開發利用具有很大的潛力，展現出誘人的應用前景：1)利用液態深層發酵菌絲體生產毛木耳多糖，藥理研究表明[5-9]毛木耳多糖具有凝血、抗衰老、抗血栓、降血脂、免疫增強和抗腫瘤等作用；2)生產毛木耳液體菌種，實踐證明液體菌種具有生產周期短、菌齡一致、菌絲發育點多、萌發快、成本低等優點[3,10-11]；3)利用深層發酵產物開發功能性食品、營養飲品和保健品[12]。

目前，國內外關于毛木耳深層發酵技術的研究報道很少。Jonathan等[13]研究了野生采集毛木耳菌株在液體培養基中的生長條件；Xu等[14]采用均勻設計和回歸分析的方法對毛木耳深層發酵條件進行了優化。國內的一些研究主要是集中在毛木耳深層發酵菌絲體的營養成分研究、液體菌種的應用研究及發酵條件研究方面[1,10,15-16]，暴增海等[16]報道了關于黃背毛木耳的液體發酵培養優化，而針對白背毛木耳深層發酵技術的系統研究尚未見報道。本實驗擬以白背毛木耳發酵菌絲體干質量(生物量)為目標產物，采用正交試驗和響應面分析法分別對發酵培養基組分和發酵條件進行優化，以期為白背毛木耳深層發酵技術規模應用和發酵食品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

白背毛木耳采自江蘇省泗洪產區子實體，經PDA培養基組織分離、純培養，保藏。

1.1.2 種子發酵培養基

玉米粉1g/100mL、豆粕1g/100mL、葡萄糖2g/100mL、牛肉膏0.5g/100mL、磷酸二氫鉀0.1g/100mL、硫酸鎂0.1g/100mL、VB10.01g/100mL，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體干質量測定

將發酵醪液過80目不銹鋼標準篩，用蒸餾水沖洗3次，將過濾所得的菌絲體于60℃電熱培養箱中烘干至質量恒定，用電子天平稱質量，得菌絲體細胞干質量。

1.2.2 搖瓶發酵

將白背毛木耳液體菌絲體接種到發酵培養基中，接種量為10%，置于25℃，180r/min的恒溫搖床上振蕩培養6 d。

1.2.3 發酵培養基單因素試驗

1.2.3.1 碳源的選擇

考察葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉6種碳源對發酵產菌絲體的影響，確定出最佳碳源。培養基組成為：蛋白胨0.15g/100mL、磷酸二氫鉀0.3g/100mL、硫酸鎂0.15g/100mL、碳源2g/100mL、pH值自然。之后對篩選出的最佳碳源進行濃度添加試驗，以確定最佳水平范圍。

1.2.3.2 氮源的選擇

考察牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出汁、玉米粉、麩皮、豆粕6種氮源對發酵產菌絲體的影響，確定最佳氮源。培養基組成為：葡萄糖2g/100mL、磷酸二氫鉀0.3g/100mL、硫酸鎂0.15g/100mL、氮源0.15g/100mL，pH值自然。之后對篩選出的最佳氮源進行濃度添加試驗，以確定最佳水平范圍。

1.2.3.3 無機鹽的選擇

分別考察KH2PO4、MgSO4兩種無機鹽的添加量對發酵產菌絲體的影響。KH2PO4添加量為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35g/100mL。MgSO4添加量為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3g/100mL。

1.2.4 發酵條件單因素試驗

1.2.4.1 發酵溫度

搖床轉速180r/min，發酵時間為6d條件下分別考察22、24、26、28、30、32℃不同發酵溫度對發酵產菌絲體的影響，確定最佳發酵溫度。

1.2.4.2 搖床轉速

在發酵溫度25℃，發酵時間為6d條件下，分別考察120、140、160、180、200、220r/min轉速條件下對發酵產菌絲體的影響，確定最佳搖床轉速。

1.2.4.3 發酵時間

在溫度25℃、搖床轉速180r/min條件下，發酵開始后每隔24h測定菌絲體干質量和發酵液pH值，確定最佳發酵時間。

1.2.5 發酵條件Box-Behnken中心組合試驗設計及響應面分析[17-18]

采用Box-Behnken中心組合試驗設計，進一步進行三因素三水平的響應面分析實驗。確定最佳的發酵條件。編碼與因素對應關系如表1所示。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基單因素試驗結果

2.1.1 碳源對發酵產菌絲體的影響

圖1 碳源對白背毛木耳菌絲體深層發酵的影響Fig.1 Effect of carbon source on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

由圖1可見，發酵培養基最佳碳源為葡萄糖，菌絲體干質量濃度可達1.45g/100mL。其次為可溶性淀粉，果糖對菌絲體生長作用最小，菌絲體干質量濃度僅為0.32g/100mL。由圖2可見，葡萄糖質量濃度為2g/100mL時，菌絲體干質量濃度達最大值，為1.53g/100mL。

圖2 葡萄糖質量濃度對白背毛木耳菌絲體深層發酵的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

2.1.2 氮源對發酵產菌絲體的影響

圖3 氮源對白背毛木耳菌絲體深層發酵的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

圖4 酵母浸出汁質量濃度對白背毛木耳菌絲體深層發酵的影響Fig.4 Effect of yeast extract concentration on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

由圖3可見，最佳氮源為酵母浸出汁，菌絲體干質量濃度達到1.61g/100mL，其次為蛋白胨，麩皮對菌絲體生長作用最小。可能是酵母浸出汁中豐富的生長因子促進了白背毛木耳菌絲體的生長。由圖4可知，當酵母浸出汁質量濃度為0.3g/mL時，菌絲體干質量濃度達1.67g/100mL。

2.1.3 無機鹽對發酵產菌絲體的影響

圖5 無機鹽質量濃度對白背毛木耳菌絲體深層發酵的影響Fig.5 Effect of inorganic salt concentration on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

由圖5可見，KH2PO4最佳質量濃度為0.2g/100mL，MgSO4最佳質量濃度為0.1g/100mL。

2.2 發酵培養基正交試驗優化

基于發酵培養基單因素試驗結果，進行L9(34)正交試驗設計，以菌絲體干質量濃度為指標，正交試驗結果及分析見表2，方差分析見表3。

表2 L9(34)正交試驗結果與極差分析Table 2 Results and range analysis of orthogonal experiments

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments

表2直觀反映，第4號試驗組A2B1C2D3的菌絲體干質量濃度最大(1.86g/100mL)，是各試驗組中效果最好的；極差分析顯示，影響菌絲體發酵的因素主次順序為：A＞D＞C＞B。理論最優條件組合為A2B3C3D3，即發酵培養基中葡萄糖、酵母浸出汁、磷酸二氫鉀和硫酸鎂質量濃度分別為2.0、0.4、0.25g/100mL和0.15g/100mL時，發酵產白背毛木耳菌絲體干質量濃度最高。然而方差分析表明，每一個因素對菌絲體干質量濃度都無顯著性影響(表3)，加之酵母浸出汁為最次要影響因素，考慮到實際生產過程中降低成本的需要，酵母浸出汁的質量濃度可選取水平1，即0.2g/100mL，從而形成新的組合方案，即A2B1C3D3。對此進行驗證實驗，結果表明，在相同工藝條件下得發酵菌絲體干質量濃度1.91g/100mL，高于A2B1C2D3條件下菌絲體干質量濃度1.86g/100mL，故發酵培養基優化方案確定為A2B1C3D3。

2.3 發酵條件單因素試驗

圖6 溫度對發酵產菌絲體的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

由圖6可見，溫度從22℃上升到26℃，菌絲體干質量濃度逐漸升高，增加趨勢明顯，高于26℃時，菌絲體干質量濃度迅速下降，故發酵溫度以26℃為適宜。

圖7 搖床轉速對發酵產菌絲體的影響Fig.7 Effect of rotation speed on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

由圖7可見，當搖床轉速為180r/min時，菌絲體干質量濃度最高，轉速過高或過低均不利于白背毛木耳菌絲體的生長。

圖8 發酵時間對發酵產菌絲體的影響及發酵過程pH值變化Fig.8 Effect of fermentation time on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha and pH change during fermentation

由圖8可見，發酵前6d，隨著發酵時間延長，菌絲體干質量濃度呈快速上升趨勢，發酵液的pH值呈現逐漸下降趨勢；6d之后菌絲體干質量濃度緩慢上升直至基本穩定，同時，發酵液pH值下降趨緩至基本穩定，考慮到成本因素，將發酵時間確定為6d(144h)。

2.4 響應面試驗結果與優化分析

2.4.1 Box-Benhnken中心組合試驗設計及響應面分析采用Box-Benhnken試驗設計對白背毛木耳菌絲體發酵條件進行三因素三水平響應面分析試驗，包括12個析因試驗和3個中心試驗。并運用SAS軟件的RSREG(Response surface regression)程序對15個試驗點的響應值進行回歸分析。經回歸擬合后，確定函數表達式，結果見表4。

表4 Box-Behnken中心組合試驗設計及結果Table 4 Design of Box-Benhnken central composite experiments and biomass of mycelia

采用SAS RSREG程序對表5進行分析，可知各因素影響程度主次順序為：X1>X2>X3；X1、X2、X3、項對菌絲體干質量濃度影響極為顯著，X1X2項影響顯著，X1X3、X2X3項影響不顯著。

表5 響應曲面分析試驗二次回歸模型參數Table 5 Quadratic regression model parameters of response surface analysis experiments

運用SAS程序進行回歸擬合刪除不顯著項，簡化后的回歸方程如下：

對該方程的顯著性分析得F1=40.36，相應的概率值為0.0004；失擬項檢驗分析得F2=2.21，P=0.3261，R2=0.9864。表明方程的模型達到極其顯著；失擬性分析顯示該回歸方程無失擬因素存在，回歸模型與實測值能較好地擬合。當發酵溫度、搖床轉速和發酵時間分別為：26.118831℃、182.147041r/min、6.071156d(即145.7h)時，得到的菌絲體干質量濃度理論預測最大值為1.965585g/100mL(表 6)。

表6 響應曲面分析試驗優化值及在最優條件下的菌絲體干質量濃度Table 6 Optimal values of response surface experiments and mycelium biomass under the optimal conditions

2.4.2 響應面直觀分析

為觀察某兩個因素對發酵產菌絲體的交互影響，還需進行降維分析[17]。根據回歸方程所做的響應曲面圖及其等高線圖(圖9～11)即可對任何兩因素交互影響效應進行分析與評價，并從中確定最佳因素水平范圍。從響應面的最高點和等值線可以看出，在所選的范圍內存在極值，既是響應面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點。

圖9 溫度和搖床轉速對發酵產菌絲體交互效應的響應面及其等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between fermentation temperature and rotation speed on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

圖9顯示，當發酵時間位于中心水平(即X3為6d)時，搖床轉速軸向等高線變化密集，而培養溫度軸向等高線的變化相對稀疏，故培養溫度對響應值峰值的影響較搖床轉速影響大，發酵溫度和搖床轉速的交互作用較強。在搖床轉速為160.5～204r/min，培養溫度在24.5～27.5℃的范圍內，發酵液所能獲得的最大菌絲體干質量濃度為1.719g/100mL。

圖10 溫度和發酵時間對發酵產菌絲體交互效應的響應面及其等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between fermentation temperature and fermentation time on submerged-fermentation of mycelia from Auricularia polytricha

圖10顯示，當搖床轉速位于中心水平(即X2為180r/min)時，發酵溫度和發酵時間的軸向等高線疏密程度相似，故兩者間的交互作用不大。發酵時間為5.1～7.2d，溫度為24.5～27.5℃范圍內，發酵液所能獲得的最大菌絲體干質量濃度為1.63g/100mL。

圖11 搖床轉速和發酵時間對發酵產菌絲體交互效應的響應面及其等高線圖Fig.11 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between rotation speed and fermentation time on submergedfermentation of mycelia from Auricularia polytricha

圖11顯示，當培養溫度位于中心水平(即X1為26℃)時，搖床轉速和發酵時間的交互作用也不大。在發酵溫度25～27.5℃、發酵時間5.1～7.2d的最佳條件下，發酵液所能獲得的最大菌絲體干質量為1.823g/100mL。

2.4.3 驗證實驗

為了檢驗響應曲面法結果的可靠性，對分析得到的白背毛木耳深層發酵優化條件：培養溫度26℃、搖床轉速182r/min、發酵時間6.07d(即145.7h)進行驗證實驗，3次實驗結果發酵菌絲體干質量平均值為1.93g/100mL，與預測值誤差為±1.82%，說明模型與預測值擬合較好，回歸方程為白背毛木耳深層發酵工藝提供了一個合適的模型。

3 結論與討論

3.1 通過正交試驗、Box-Behnken試驗設計及響應面分析，實現了白背毛木耳菌絲體深層發酵工藝的優化。確定的最佳發酵培養基組分為：葡萄糖2.00g/100mL、酵母浸出汁0.20g/100mL、磷酸二氫鉀0.25g/100mL、硫酸鎂0.15g/100mL；優化發酵條件為：溫度26℃、搖床轉速182r/min、發酵時間6.07d(145.7h)。此條件下發酵菌絲體干質量濃度可達到1.93g/100mL，比優化前的產量提高了1.24倍。

3.2 用響應面分析研究的因素一般為2～3個，而對于3個以上的研究結果比較復雜[18]，所以對于培養基的優化選用L9(34)的正交試驗。響應面分析求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素的交互作用的回歸分析，所以本實驗對于發酵條件的優化選用了響應面分析方法。結果表明，響應面分析法不僅規模小，而且效果顯著，而正交試驗則更具可比性與直觀性。二者結合進行發酵工藝優化研究在降低實驗成本的同時，提高了實驗效率。

3.3 對于復雜的發酵代謝過程而言，發酵效果可以體現在生物量的增多和有效代謝產物的生成兩個方面[19]。所以，當采用不同的考察指標時，工藝優化的結論可能是不同的。由于本實驗選擇發酵生物量作為惟一的指標，研究結論僅是在此指標下的優化結果，而針對某一具體代謝產物如多糖的產生卻不一定條件最優，需要在今后的實驗中作進一步探討。

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Optimization of Submerged-fermentation Processing of Mycelia fromAuricularia polytricha

JI Hong，LI Zhi，ZHENG Li-xue
(College of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Biomass (dry weight) of mycelia was used as index to explore the optimal culture medium and processing conditions of submerged-fermentation of mycelia fromAuricularia polytricha. The optimal fermentation broth formula was investigated by Box-Behnken and response surface analysis to be 2.00 g glucose, 0.20 g yeast extract, 0.25 g KH2PO4, and 0.15 g MgSO4 in 100 mL of culture medium. The optimal fermentation conditions were fermentation temperature of 26 ℃, rotation speed of 182 r/min and fermentation time of 145.7 h. Under the optimal culture medium and fermentation conditions, the dry mycelia was up to 1.93 g in 100 mL of culture medium, which was increased by 1.24 fold compared with the conditions before optimization.

Auricularia polytricha；submerged-fermentation；biomass (dry weight) of mycelia；orthogonal experiment；response surface methodology

Q814.3

A

1002-6630(2010)23-0204-06

2010-08-20

2009年江蘇省科技廳蘇北科技專項資助項目(BN2009320)；蘇州市科技發展計劃項目(SZS201007)

冀宏(1969—)，男，研究員，博士研究生，研究方向為食、藥用菌工程技術研究及現代農業技術經濟與管理。E-mail：jihong8848@126.com