海洋浮游病毒的研究方法

李洪波, 肖 天, 林鳳翱

(1. 國家海洋環境監測中心, 遼寧 大連 116023; 2. 國家海洋局海洋生態系統與生物地球化學重點實驗室,國家海洋局 第二海洋研究所, 浙江 杭州 310012; 3.中國科學院 海洋研究所生態與環境重點實驗室, 山東青島 266071)

海洋浮游病毒的研究方法

Methods of studying marine virioplankton

李洪波1,2, 肖 天3, 林鳳翱1

(1. 國家海洋環境監測中心, 遼寧 大連 116023; 2. 國家海洋局海洋生態系統與生物地球化學重點實驗室,國家海洋局 第二海洋研究所, 浙江 杭州 310012; 3.中國科學院 海洋研究所生態與環境重點實驗室, 山東青島 266071)

浮游病毒在海洋中大量存在, 利用超離心和透射電鏡技術研究發現病毒豐度為 105～107個/mL, 遠遠超過細菌的數量。由于浮游病毒在微食物環、生源要素的循環及對宿主細胞的裂解以及控制宿主多樣性方面都具有重要作用[1～3], 所以世界各國對海洋病毒的研究發展迅速。由于技術方法方面的原因, 國內在這方面剛剛起步不久。盡管在淡水病毒研究方面已取得了一些進展[4], 但在海洋研究領域, 此部分工作還很薄弱。國內在海洋魚類病毒、貝類病毒等流行性病毒方面已取得較大進展[5～7], 而本文則將對海洋浮游病毒研究中所涉及的豐度、生產力以及病毒對宿主的影響方面的技術進行重點闡述。

1 病毒豐度的測定

1.1 間接計數法: 空斑法(plaque assay)與 MPN(most-probable-number)法

適量的噬菌體和宿主菌液混合后接種培養, 培養基表面可有透亮的溶菌空斑出現。一個空斑系由一個噬菌體復制增殖并裂解細菌后形成, 稱為噬斑(plaque)。不同噬菌體噬斑的形態與大小不盡相同。若將噬菌體按一定倍數稀釋, 通過噬斑計數, 可測定一定體積內的噬斑形成單位(plaque forming units,pfu)數目, 即噬菌體的數目。另外利用液體培養基作最大可能數目(MPN)分析。用該方法計數明顯低于用顯微鏡鏡檢100～1000倍[8]。

盡管這個方法在計數病毒中并不是很有效, 但在分離純化病毒-宿主系統中有不可替代性。尤其是在噬藍藻體的研究中, 如在墨西哥灣, Suttle[9]利用MPN法方法發現水中的噬藍藻體超過105個/mL。

1.2 直接計數法

1.2.1 透射電鏡技術(Transmission electron microscopy, TEM)

早期直接計數水體病毒(viral direct counts, VDC)的方法是用電鏡技術。1979年, Torella and Morita[10]利用電鏡第一次直接計數了＞0.2 μm 的浮游生物樣品中的病毒豐度為＞104個/mL。因大多數病毒通過了0.2 μm的濾膜, 其豐度被大大低估了。電鏡計數樣品中的病毒顆粒大約在 103～106個/mL。電鏡技術可同時提供病毒形態多樣性方面的證據, 包括蛋白外殼和尾部大小[11]。

最普通的電鏡方法是直接沉降自由的病毒顆粒,從未過濾的由戊二醛固定的水樣沉降到 Formvar-噴碳銅網上。有兩種方法可把水體中的病毒收集到銅網上： 超濾(ultrafiltration)和超離(ultracentrifugation)。通過超離病毒直接收集在電鏡銅網上或者通過濃縮后轉移到銅網上, 然后在電鏡下觀察[11～13]。TEM 病毒直接計數要求顆粒達到的最低濃度是 105個/mL, 因而在貧營養環境中TEM技術受到限制[14]。另外由于染色和在銅網上的不均勻分布, 導致計數自然水域的病毒有大約20%～25%的誤差[15]。

TEM 直接計數的缺點是裝備要求高, 如透射電子顯微鏡和超速離心機。另外樣品準備和分析也是耗時繁瑣的。

1.2.2 熒光顯微鏡技術(epifluorescence light microscopy, ELM)

本質上說, 熒光顯微鏡計數病毒是在直接計數細菌技術上的變更。病毒殼內的核酸被核酸染料染色, 病毒被過濾到小孔徑(≤002 μm)濾膜上, 用高倍鏡觀察。一個明顯的缺點就是小的浮游細菌和大的病毒顆粒在大小上重疊, 這會導致病毒計數的偏差。通過提高染料的特異性, ELM 直接計數病毒方法已與 TEM方法達到相似的準確度, 且超過TEM計數結果[15]。

在新的熒光標記物SYBR Green I出現之前, 有用DAPI和Yo-Pro-1染色劑的[15,16], 現在也有新的替代品, 有研究認為利用SYBR Green Gold 染色效果會更好, 但染料昂貴, 不值得推薦。另外研究[17]認為YO-PRO-1染料更適合熒光顯微鏡下計數病毒, 是因為此染料有較強且穩定的熒光。相比SYBR Green I染料熒光淬滅較快, 不易計數和拍照。YO-PRO-1可被波長為 491nm的藍光激發, 發出波長為509 nm的黃綠色熒光。但由于其染色時間較長, 長達2 d, 使用起來不方便。而SYBR Green I染色時間較短(小于15 min), 亮度較高, 且不受固定劑的影響。只要在染色后添加熒光保護劑, 就可避免熒光淬滅過快[17～19]。

中國詩歌中傳達“意境”的思想源遠流長，（陶淵明《飲酒》）“采菊東籬下，悠然見南山”中東籬是實實在在的事物，“東籬”后來常被詩人作詩用到。（李清照《醉花陰》）“東籬把酒黃昏后，有暗香盈袖”這句詩中的“東籬”便不是實指在東籬喝酒作樂，而是指一種意境。詩中的意象也是不勝枚舉，例如關乎離別的意象是“楊柳”（楊柳東風樹，青青夾御河）；關乎思念家鄉的意象是“明月”（舉頭望明月，低頭思故鄉）；關乎思友的意象是“白云”（水底分明天上云，可憐形影似吾身）。譯者要深入詩中意境觀其意象，感受詩人此時此景的特殊情感，才能收受其意象的感染力。

由于固定劑和保存條件的不同, 常常低估了病毒的豐度。研究認為用戊二醛和甲醛固定的樣品, 在其前 2小時內, 病毒平均損失率分別為 0.12 h-1和0.13 h-1。16天后, 病毒豐度已下降了72%。要準確測定病毒豐度, 最好采樣后不用固定劑而是立即抽濾染色, 把制成的玻片放置在-20℃, SYBR Green I染色的可放置 2周, 而用 Yo-Pro-1染色的可放置 1年。另一方面, 樣品固定后用液氮瞬時冷凍后在-80℃條件下保存。只有做到以上兩點才可避免對病毒豐度的低估[20]。一種新型熒光探針 GeneFinderTM,價格相對便宜, 效果與SYBR Green I效果不差上下。熒光顯微鏡適合現場研究病毒豐度。

1.2.3 流式細胞儀技術(Flow Cytometry, FCM)

近十幾年來, 流式細胞術(flow cytometry) 已被廣泛應用于海洋生物學研究。最初被用于植物種群的區分與計數, 接著又被用于異養細菌群落研究,而這幾年則被開發用于海洋病毒的分析[21]。流式細胞術主要優勢在于能快速分析大量細胞, 并獲取數據易于進行多元數據分析, 準確性得到提高, 誤差減小, 檢測下限與靈敏度都得以提高。同時新型核酸染料 SYBR Green-I 的發明也推進了流式在病毒檢測中的應用[19,21]。Chen 等[22]用 FCM法分辨出至少4種不同病毒類型, 可分為真核藻類病毒、原核藻類病毒、高DNA噬菌體和低DNA噬菌體。

2 病毒生產力的研究方法

2.1 放射性標記技術

來源于測定細菌二次生產力的方法[23], Steward開創了[3H]或[32P]被病毒核酸吸收基礎上的現場估計病毒生產力的方法[24]。這個方法的基本原理是用3H或32P標記浮游病毒的核酸, 然后計數宿主裂解后的放射性標記物的量, 這個量所代表的就是病毒生產量, 最后用病毒生產量除以病毒的平均裂解量(burst size)就能夠推算出被感染的宿主數量。這個方法有一個假設前提, 那就是： 噬菌體合成中用的核苷酸來源于宿主細胞核酸庫或者外源的而并非重新合成的[25]。這個方法依賴于過濾把細菌和病毒分離開來, 然后測量標記的病毒DNA數量。在將放射性標記量轉化成病毒的生產量時, 還需要一個轉化系數。通常這個系數是通過比較用其他方法測量的標準PHS (phage-host system)中的病毒的數量變化和放射性標記物的數量變化來得到的[24,25]。但迄今為止,系數的選擇沒能達成統一, 不同的研究者使用這種方法得到的病毒導致的致死率是有極大差異的。在用3H-TdR作為示蹤物時, 使用的轉換系數有6.17×1020個/mol或 2×1021個/mol。在用32Pi作為示蹤物時候, 轉化系數為 1.25×1020個/mol。由于32Pi在DNA病毒測量中的限制, 目前3H-TdR比32Pi被更廣泛的應用[26,27]。

此方法能夠直接測定病毒的生產速率并推算它所造成的致死率, 而且也可以用于直接記錄病毒粒子的降解率, 同時還提供了有關物質從浮游細菌流向浮游病毒的直接證據[24]。缺點是被標記的細菌DNA容易分解成病毒大小的部分, 同時需要適當的轉化系數把放射性標記量轉化為病毒生產量。

2.2 熒光標記病毒(Fluorescently Labeled Viruses, FLV)技術[28]

此方法與放射性標記的原理一樣, 更使用于貧營養和避光培養的PHS 體系。該方法能同時測定病毒降解率、生產率和轉化率。熒光標記的病毒作為示蹤物添加到培養水體中, 監測FLVs和總病毒豐度的變化。病毒生產率能用FLV豐度的改變率和總豐度的變化率計算得出。缺點是需要制備熒光標記的病毒顆粒, 這個過程比較繁瑣, 利用率較低。

2.3 氰化物抑制法

假定病毒豐度保持相對穩定(病毒衰減被病毒生產所平衡), 那么病毒生產停止后就可以從病毒移除率中估算出來病毒生產率[29,30]。病毒衰減率是利用抑制新病毒顆粒的產生, 然后檢測一段時間內病毒豐度的降低而被估算出來的。氰化物經常被用作抑制劑殺死宿主細胞而并不能使自由的噬菌體顆粒失去活性。由于太陽光輻射、酶還有其他因素均可引起病毒的衰減。因而在不同地區利用病毒衰減得到的生產率沒有可比性[31], 限制了該方法的推廣。

2.4 稀釋方法

2002年, Wilhelm等[32]用稀釋技術估計了病毒生產力。該方法操作相對簡單, 已在較多科研方面得到應用。具體操作如下： 把450 mL水樣中的細菌收集到直徑47 mm、孔徑0.2 μm的聚碳酸酯膜。然后用不含病毒顆粒的超濾海水(＜30 ku)把濾膜上的細胞重新懸浮起來, 保持到最初體積。這樣病毒豐度就被稀釋到大約原濃度的10%～20%。水樣分裝到3個瓶子, 用鋁箔包裹, 現場溫度下培養。每隔2.5 h取樣一次(4 mL, 戊二醛固定, 終濃度2.5%)。每一個試驗限制在10 h內。

用病毒生產量對時間的一階線形回歸得到病毒平均生產率(個/(mL·h))。

到目前為止, 測定病毒生產力并沒有標準的方法。上面的方法各有優缺點。然而, 獲取可靠的生產力對于估計病毒對細菌死亡率的貢獻和病毒介導的營養鹽釋放都是非常重要的。

3 病毒介導的死亡率(Virus induced mortality, VIM)

3.1 以電鏡方法為基礎研究病毒介導的死亡率

透射電鏡(TEM)被用來觀看病毒形態和決定被感染的細胞頻率(Frequency of visibly infected cells,FVIC), 包含病毒的細胞數目。包含成熟噬菌體的浮游細菌僅代表被病毒感染數量的一小部分, 因為完整無缺的病毒外殼只有在感染周期的后期才能看到。為了準確估計病毒溶源效應, 需要利用轉換因子把FVIC值轉化為全部被感染的細胞頻率(FIC)[33～35]。用到的轉化因子有 10, 4.34～10.78(平均 7.11)[34], 3.7～7.14[36]。Binder[33]認為在FVIC與FIC之間存在非線性的關系, 得到如下的數學模型：

MVMB(viral-mediated bacterial mortality, MVMB)代表采樣時間給定的細菌種群內病毒介導的死亡率,能利用下面的模型推導出來[33]：

而病毒介導的細菌死亡率可由下式計算得出,MVIM= MVMB×PB(細菌生產力)[35]。

在河北沿岸采取該方法, 研究了春季由病毒感染而導致的細菌死亡率達 40%PB以上[37], 由此證明在近岸富營養化海區病毒對細菌衰亡、碳循環過程都有重要的作用。

3.2 以稀釋方法來估計由病毒引起的細菌死亡率

由于VIM代表用裂解量去除病毒生產力得到的由于病毒溶源而裂解的細胞數目[30], 即VIM = 病毒生產力/裂解量。要得到由于病毒感染而死亡的細菌占細菌總數的比例, 那么得到的 VIM還需除以細菌豐度, 即VIM(%) = (病毒生產力/裂解量) /細菌豐度。裂解量(Burst Size)被估計為所有可見感染的細胞內的平均病毒顆粒(最小裂解量)或者細胞內完全裝滿病毒顆粒的平均病毒數量(最大裂解量)。病毒裂解量通過計數至少有 15個可見的感染細菌細胞(visibly infected bacterial cell, VIC)內的病毒顆粒, 每一個可見感染細胞內至少要有 5個噬菌體。在文獻內常用的裂解量有兩個值 20和 50, 平均值為 24[8]。BS受到許多因素的影響, 如宿主細胞和病毒的大小、宿主和噬菌體的代謝活性以及宿主多樣性、溫度、季節等[30]。

Suttle[1]綜述認為由于病毒感染, 每天大約有10%～20%的異養細菌消失, 藍細菌則相當少(大約3%)。在自然環境里, 由病毒介導的細菌死亡率大約為 15%～20% d-1[1,30]。

4 病毒對宿主多樣性的影響

病毒對海洋系統最令人關注的就是對群落組成的潛在影響。這是因為： (1)病毒對宿主通常是特異性的, 大多情況下被認為是種類特異性[38]; (2)感染是一個依賴密度的過程。在高密度宿主情況下, 增加的接觸率導致感染率升高。根據上面兩個情況, 有專家提出病毒對宿主的感染符合“殺死優勝者” (Killing-the-winner)的假設[1,39]。

一個典型病毒控制宿主群落多樣性的試驗就是在存在和缺乏病毒情況下, 細菌群落的改變狀況。試驗如下： 接種體用0.6 μm聚碳酸酯核孔濾膜過濾的自然海水(除去原生動物)。培養體是兩種, 一種是用0.02 μm核孔氧化鋁濾膜過濾不含病毒的海水; 另一種是用0.2 μm核孔濾膜過濾的包含病毒的海水。培養2～4 d, 利用DGGE技術監控細菌群落組成的改變狀況[40]。

對浮游病毒的研究不單單要研究其生態分布狀況, 今后還要加強如下工作： (1)病毒在元素循環方面的貢獻; (2)由病毒引起的宿主死亡率大小; (3)病毒形態、基因多樣性研究; (4)利用病毒進行赤潮治理方面的研究。

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Q331

A

1000-3096(2010)09-0097-05

2008-10-08;

2008-12-03

國家自然科學基金資助項目(40906082); 國家海洋局青年基金資助項目(2010111); 國家海洋局海洋生態與海洋生物地球化學重點實驗室開放基金資助項目(LMEB 200604); 中國科學院海洋生態與環境科學重點實驗室基金資助項目(KLMEES201002)

李洪波(1976-), 男, 河南漯河人, 助理研究員, 博士, 主要從事海洋微生物生態研究, 電話： 0411-84782711, E-mail： hbli@nmemc.gov.cn

(本文編輯： 張培新)