大米草多糖的提取及其單糖組成的GC-MS分析

徐年軍, 何艷麗, 武 敏, 嚴小軍

(寧波大學生命科學與生物工程學院, 教育部應用海洋生物技術重點實驗室, 浙江 寧波 315211)

大米草多糖的提取及其單糖組成的GC-MS分析

徐年軍, 何艷麗, 武 敏, 嚴小軍

(寧波大學生命科學與生物工程學院, 教育部應用海洋生物技術重點實驗室, 浙江 寧波 315211)

分析了海洋灘涂生物大米草(Spartina anglica)中的多糖成分和單糖組成, 為這種生物資源的開發提供科學依據。利用水提醇沉、Sevag法脫蛋白得到純大米草多糖, 經三氟乙酸降解、糖腈乙酸酯衍生,最后用氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)分析大米草多糖中的單糖組成。結果表明大米草單糖組成為鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖, 其質量分數分別是： 4.13%, 3.02%, 11.94%, 8.89%,6.82%, 27.18%, 38.00%。大米草多糖是一種可利用的食品資源, 其主要成分半乳糖、葡萄糖都是營養價值很高的單糖, 大米草多糖可深入研究開發其生物活性用作保健食品。

大米草(Spartina anglica); 多糖; 單糖組成; GC-MS分析

大米草(Spartina anglica)是一種具有生態影響的海洋灘涂植物, 目前對我國沿海生態和生物多樣性、灘涂養殖等造成了較大的負面影響。但大米草是一種具有頑強生命力的植物, 其有效的控制和生態防除是一個世界性的難題[1]。同時大米草在沿海灘涂防風護堤、促淤造田等方面也具有一定的正面生態效應[2]。在這種情況下, 對大米草生物資源的開發利用是一種最佳的選擇[3]。

大米草生物量大、用途很多, 大米草多糖和黃酮類活性物質可用作保健食品。關于大米草多糖的新聞報道很多, 主要涉及多糖的提取等, 如上海壽琪多糖食品研究所與福州中衛多糖科技公司合作進行了大米草多糖的提取并申請了相關的專利。但大米草生物活性物質的研究報道很少, 大米草多糖理化性質及單糖組成分析方面的研究未見報道[4]。作者首次研究了大米草多糖的單糖成分分析, 為大米草多糖的開發利用打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

新鮮大米草(Spartina anglica)于2005年4月采于浙江象山縣鶴浦沿海灘涂。大米草洗凈后去除根部,將莖葉剪碎后備用。

1.2 儀器和試劑

單糖標準品購自美國 Sigma-Aldrich公司, 本實驗中所用的主要有赤蘚糖(erythrose)、鼠李糖(rhamnose)、核糖(ribose)、阿拉伯糖(arabinose)、巖藻糖(fucose)、木糖(xylopyranose)、甘露糖(mannose)、葡萄糖(glucose)、半乳糖(lactose)和肌醇(inositol)。試劑盒 HMDS(Hexamethyldisilazane, 六甲基二硅胺烷)+TMCS, 3：1(Sylon HT)購自美國 Supelco 公司, 其他試劑為國產分析純。主要分析儀器有島津公司的氣相色譜-質譜儀(Shimadzu QP2010 GC-MS), Supelco 公司生產的30 m×0.25 mm×0.25 μm SPB-50色譜柱; Thermo公司的Multiskan MK3型酶標儀等。

1.3 實驗方法

1.3.1 大米草多糖的提取純化

新鮮大米草樣品40 g于60oC烘干12 h, 液氮冷凍后碾碎, 于90oC恒溫水浴浸提5 h, 過濾, 濾渣重復提取2次, 合并提取液, 旋轉蒸發濃縮至100 mL。加入乙醇于冰箱中過夜沉淀, 沉淀物用無水乙醇洗滌數次, 60 mL水溶解。按Sevag法[5]除蛋白質, 透析除去雜質。加適量蒸餾水溶解, 冷凍干燥, 得大米草多糖共64 mg。

1.3.2 大米草多糖的進一步純化

將得到的大米草多糖樣品進行 Sephadex DEAE A50凝膠柱層析(2.2 cm×20 cm), 蒸餾水和1 mol/L NaCl恒速洗脫, 等體積自動接收, 硫酸苯酚法[6]檢測洗脫樣品中的總糖含量, 繪制洗脫曲線, 根據洗脫樣品峰截取第8～18管(每管4 mL, SPI), SPI為大米草多糖主要組分, 為均一多糖。

1.3.3 多糖降解時間的確定

在4個反應瓶中各自加入15 μL的2 g/L的大米草多糖溶液, 氮氣吹干后分別加入1 mL的2 mol/mL的三氟乙酸, 120oC分別油浴45、60、75、90 min, 獲得4個降解單糖樣品, 加入甲醇1 mL(3次), 減壓蒸餾徹底去除三氟乙酸。

1.3.4 醛糖衍生化

單糖標準品和降解單糖樣品分別加入10 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶, 密封條件下在90oC加熱反應30 min生成糖肟, 加入1：1的醋酸酐后90oC油浴30 min生成具有揮發性的糖腈乙酸酯衍生物, 氮氣吹干后用二氯甲烷定容, GC-MS進樣分析。每個樣品作3個平行樣。

1.3.5 酮糖衍生化

酮糖衍生化直接用試劑盒, 待測樣品加入六甲基二硅胺烷(HMDS)80oC油浴60 min后生成可揮發的衍生物, 氮氣吹干后正己烷定容, 直接進行GC-MS分析。每個樣品作3個平行樣分析。

1.3.6 GC-MS檢測條件

主要實驗條件參照Ye等[7]。GC條件： 進樣口溫度為250, ℃載氣為99.99%的高純氦, 柱流速1 mL/min, 初始柱前壓26.3 kPa, 柱起始溫度100, ℃保持3.5 min, 以15/min℃升至160, ℃保持20 min,再以15/min℃升至200, ℃保持15 min, 再以20/min℃升至280, ℃保持5 min。分流進樣, 分流比為9.6。

MS條件： 用電子轟擊(Electron Impact, EI)源分析, 電子能量為70 eV, 離子源溫度200, ℃接口溫度250℃。選取全程離子碎片掃描(SCAN)模式時, 質量掃描范圍為50～600, 溶劑延遲3.5 min。選取特征離子碎片掃描(SIM)模式時, 醛糖選用145 m/z、酮糖選用217 m/z為定量時的目標離子, 另選兩個離子作為定性時的參考離子。

2 結果與討論

2.1 大米草多糖的提取率

本實驗為了保證提取樣品的純度, 提取率不是很高, 僅為0.16%。提取過程中的主要損失步驟包括酒精沉淀、有機溶劑去蛋白、乙醇洗滌及層析柱純化等。不同的提取方法, 特別是多糖提取過程中的脫蛋白的方法很多, Sevag法是比較經典的方法, 目前已經廣泛用于生物樣品中糖復合物的提純及提取過程中蛋白質的去除[6]。

大米草多糖的提取未見有專業文獻報道。新聞報道中只提到雙酶水解法和超低溫冷凍干燥技術獲得大米草多糖, 但具體的提取方法未見報道。相關的專利中大米草多糖的提純方法(申請號：200410069331.7)主要采用浸泡、酶解法獲得大米草多糖, 采用超濾膜分離技術將大米草濃縮液過濾,從而使大米草多糖的純度提高了 60%以上, 沒有對大米草多糖進行進一步純化, 沒有獲得提取率等參數。

本文采用的提取方法具有較好的重復性, 特別是提取的純度高, 可用于進行單糖組成分析和結構分析, 在隨后的實驗中也采用這種提取方法, 均獲得了較滿意的結果。

2.2 大米草多糖的純度測定

大米草多糖用 Sephadex G-100柱層析法檢測,得到了一個主要的洗脫峰, 根據其對稱性特點判斷其為均一多糖。紫外分光光度法檢測表明大米草多糖無蛋白質存在。

2.3 大米草多糖酸降解時間的確定

在運用三氟乙酸對大米草多糖進行降解時, 研究了不同時間梯度下(45, 60, 75, 90 min)所獲得的大米草單糖組成差異, 結果其組成和含量無顯著差異(P＜0.05), 本文取含量相對較高的 60 min作為最佳降解時間。

2.4 單糖標準品的GC-MS色譜分析

由于酮糖分析中未檢測到酮糖, 本文僅列出 10種醛糖的檢測及其定量結果。

圖 1為用 SIM 模式檢測得到的 10種醛糖的GC-MS色譜圖, 圖示了10種單糖的出峰時間, 其中1為赤蘚糖, 2為鼠李糖, 3為核糖, 4為阿拉伯糖, 5為巖藻糖, 6為木糖, 7為甘露糖, 8為葡萄糖, 9為半乳糖, 10為肌醇,其出峰時間分別是15.47, 30.77, 30.99 , 31.77 ,31.88 , 32.67, 43.61, 44.96, 46.01, 48.22 min。根據其質譜裂解峰分別對其對應的峰進行了確認。

2.5 大米草單糖的GC-MS色譜分析

運用同樣的方法對大米草多糖進行單糖組成分析(圖2)。結果運用GC-MS分析方法, 從大米草單糖中共檢測出7個明顯的波峰, 根據與標準圖譜(圖1)的出峰時間對比, 以及對該峰的質譜鑒定, 可判斷出大米草單糖組成為鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。根據各峰面積比計算其相對百分含量, 分別為 4.13%, 3.02%, 11.94%,8.89%, 6.82%, 27.18%, 38.00%。

結果表明大米草多糖的單糖成分中主要是半乳糖(38.00%), 葡萄糖(27.18%)和阿拉伯糖(11.94%),共占單糖總量的77.12%。而這3種糖都是人類食品中主要的單糖成分, 表明大米草多糖是一種很好的多糖資源, 可用于開發相關的保健食品或藥品。

圖1 標準單糖的GC-MS色譜圖Fig. 1 GC-MS chromatogram of standard monosaccharides

圖2 大米草單糖的GC-MS色譜圖Fig. 2 GC-MS chromatogram of the monosaccharides from Spartina anglicaa.赤蘚糖, b.鼠李糖, c.核糖, d.阿拉伯糖, e.木糖, f.甘露糖, g.葡萄糖, h.半乳糖, i.肌醇a. Erythrose, b. Rhamnose, c. Ribose, d. Arabinose, e.Xylopyranose, f. Mannose, g. Glucose, h. Lactose, i. inositol

2.6 GC-MS進行單糖分析的優點

目前對多糖的單糖組成分析主要用氣相色譜法(GC)[8]、高效液相色譜(HPLC)[9]或者高效毛細管電泳(HPCE)分析。一般認為, GC、HPLC、HPCE在定量方面具有一定的優勢, 但在定性方面卻存在不足：單純依靠時間定性不夠準確, 特別是有雜質峰干擾的情況下, 無法準確判斷色譜圖中的峰是屬于樣品峰, 還是屬于雜質峰。相對 GC-MS, 氣相色譜所獲得的色譜峰缺乏選擇性, 雜質峰混在樣品峰中勢必帶來峰面積的增加, 樣品處理過程中的雜質也容易引起積分面積的變化, 給樣品制備和定量帶來了一定的困難。GC-MS在單糖組成的定性方面具有特效、快速的特點, 依靠其 FID圖譜的峰面積定量具有和直接用GC的色譜圖同樣的效果[10,11]。

2.7 大米草多糖成分分析的意義

大米草是一種具有負生態效應的海洋灘涂生物,對其開發利用具有很重要的經濟和社會生態意義,許多報紙上都介紹了上海壽琪多糖食品有限公司在大米草多糖提取上的成功事例。但到現在為止, 該技術還未見有新的進展, 主要因為大米草多糖究竟有什么樣的生物活性還不是很清楚, 相關的應用性基礎研究還有很多工作有待完成。本實驗室對大米草多糖進行了一年多的研究, 發現了大米草多糖降解產物對羥基自由基具有較強的清除活性, 對α-葡萄糖苷酶也具有一定的抑制活性(數據未發表)。而對大米草多糖的組成分析是深入了解大米草多糖的結構和化學組成的必要步驟。接下來的工作我們準備用不同方法降解大米草多糖, 研究其降解產物的化學結構與生物活性之間的關系, 為大米草開發利用提供理論基礎和技術支持。

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Extraction of polysaccharides from Spartina anglica and analysis of the monosaccharide composition by gas chromatography-mass spectrometry

XU Nian-jun, HE Yan-li, WU Min, YAN Xiao-jun
(Applied Marine Biotechnology Key Laboratory of the Ministry of Education, College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Mar., 9, 2010

Spartina anglica; polysaccharides; monosaccharide composition; GC-MS

To study the polysaccharides and analysis their monosaccharide compositions of the Spartina anglica, purified polysaccharides were obtained by hot water extraction, ethanol precipitation, and de-protein by Sevag method. The polysaccharides were hydrolyzed to monosaccharides by 2 mol/mL trifluoroacetic acid in 120℃ oil-bath for 1h. The derived monosaccharides were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The S. anglica polysaccharides consisted of rhamnose, ribose, arabinose, xylopyranose, mannose, glucose, lactose, with their relative percentages being 4.13%, 3.02%, 11.94%, 8.89%, 6.82%, 27.18%, and 38.00%, respectively. It is predicted that the polysaccharides of the S. anglca are a potential food resource, with the main monosaccharides, i.e. lactose and glucose, being of very high nutritional value. Further study for their applications in functional foods is warranted.

Q539

A

1000-3096(2010)09-0015-04

2010-03-09;

2010-04-23

浙江省衛生廳項目(2005B149); 浙江省自然科學基金項目(Y507263); 浙江省錢江人才計劃項目(2007R10038); 寧波市自然科學基金項目(2007A610071)

徐年軍(1973-), 男, 湖北赤壁人, 博士, 研究員, 主要從事海洋生物活性物質研究,電話： 0574-87600458, E-mail： xunianjun@nbu.edu.cn

(本文編輯: 張培新)