蛋白質高效分離兩維色譜柱的選擇優化

洪廣峰, 高明霞, 晏國全, 關 霞, 陶 芊, 張祥民,2＊

(1.復旦大學化學系,上海200433;2.復旦大學生物醫學研究院,上海200433)

蛋白質高效分離兩維色譜柱的選擇優化

洪廣峰1, 高明霞1, 晏國全1, 關 霞1, 陶 芊1, 張祥民1,2＊

(1.復旦大學化學系,上海200433;2.復旦大學生物醫學研究院,上海200433)

為了構建高效的離子交換/反相二維液相色譜(IEC/RPLC)分離平臺系統,提高復雜蛋白質樣品的分離效率,對色譜柱進行了評價與篩選。通過對實際人肝蛋白質樣品的分離效果的比較,選擇確定了TSKgel D EAE-5PW弱陰離子交換色譜柱(WAX)作為第一維色譜分離柱;考察了同一規格的10支代表性反相色譜柱(250mm×4.6 mm,5μm,30nm,C4、C8或C18),通過評價其對尿嘧啶、硝基苯、萘和芴的分離性能以及對3種標準蛋白質樣品的非特異性吸附、對人肝蛋白質樣品的WAX餾分的分離效果,最終確定以Jupiter300C4反相色譜柱作為第二維色譜分離柱。對兩維色譜柱的選擇優化為蛋白質高效分離二維液相色譜平臺的搭建提供了可靠基礎。

蛋白質組學;多維液相色譜;蛋白質;Top-dow n技術

Abstract:In order to optimize two-dimensional liquid Chromatographic(2D-LC)columns for highly efficient separation of proteins,several liquid Chromatographic columns were investigated and evaluated.Weak anion-exchange(WAX)column was chosen as the first dimension because of its extensive protein separation power.By comparison of different WAX Chromatographic columns for hum an liver protein separation,TSKgelD EAE-5PW column was selected as the first dimension of a2D-LC system.For the second dimension,ten typical reversed-phase(RP)LC columns(250mm×4.6mm,5μm,30nm)were investigated and evaluated.Their silica based RP stationary phases were butyl(C4),octyl(C8)or octadecyl(C18).To evaluate the retention behavior and non-specific protein adsorption ability of these ten columns,four neutral com pounds(uracil,nitrobenzene,naphthalene and fluorene)and three standard proteins(cytochrome C,myoglobin and album in from chicken egg white)were adopted and separated by RPLC.Meantime,WAX fractions were used to investigate the separation ability of different alkyl-bonded silica stationary phase columns for complex protein samples.B y comparison of column separation efficiency,adsorption of intact proteins and sample analysis,Jupiter 300C4column was finally employed for its excellent separation ability.Optimization of WAX and RPLC columns offers reliable foundation for the construction of2D-LC protein separation system s.

Key words:proteomics;multidimensional liquid Chromatography;intact protein;Top-down

隨著人類基因組計劃的完成,蛋白質組學已成為后基因組研究的重點。相對于基因組學而言,由于蛋白質表達的多樣性和翻譯后修飾的復雜性,其研究更加依賴于新技術新方法的發展。生物色譜與質譜技術的進步推動了蛋白質組學研究的迅猛發展,形成了基于完整蛋白質分離的Top-dow n路線和基于肽段串級質譜鑒定的B ottom-up路線[1-4]。雙向凝膠電泳技術盡管在蛋白質組學研究中的重要性眾所周知,然而其本身仍存在一些難以克服的缺陷,如動態范圍有限,對樣品中低豐度蛋白質、疏水蛋白質以及極酸極堿性蛋白質的分辨能力較差,操作費時費力等[5];B ottom-up技術路線需先進行蛋白質酶解,此步驟產生了比蛋白質樣品更加復雜的酶解肽段,對色譜的分離能力和質譜的鑒定速度提出了挑戰,還會損失完整蛋白質的信息[6]。

高效液相色譜(HPLC)技術具有快速、高效、自動化程度高等優點,根據G iddings的多維分離系統數學模型[7,8],通過有效正交實現聯用的多維液相色譜分離技術具有更大的峰容量,可以實現復雜蛋白質樣品的高效分離,而且可以通過增大上樣量來分離富集中低豐度蛋白質,因而得到了廣泛的應用[9-11]。以往的研究多采用蛋白質酶解肽的多維色譜分離策略,但是越來越多的事實表明,基于蛋白質水平的分離與鑒定更加可靠,而且可以獲得蛋白質含量、后修飾等重要信息。高明霞等[12]利用構建的強陽離子交換色譜/反相高效液相色譜(SCX/RPLC)分離系統,對鼠肝蛋白質進行了兩維高效分離并將高豐度蛋白質高效去除,大大提高了蛋白質的鑒定數量和可靠性。通過多維液相色譜高效分離實現Top-dow n技術路線分析正成為研究的主要方法[13-17]。這種基于完整蛋白質分離的策略其關鍵還是要提高復雜蛋白質樣品的分離效率,而和SCX色譜柱比較,弱陰離子交換作為第一維色譜可以減少樣品酸化過程的損失,增大蛋白質的上樣量;RPLC對多維液相色譜總峰容量的貢獻很大,可以提高復雜蛋白質樣品的分辨率,將其作為第二維色譜還可以在線除鹽。因此,優化離子交換色譜/RPLC二維分離系統對于蛋白質的分離有重要的應用意義。本研究對二維分離系統的核心色譜柱進行了篩選,并系統評價和考察了其分離性能,解決了蛋白質水平兩維色譜分離系統中色譜柱的最優化問題。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

島津LC-2010高效液相色譜儀(日本Shim adzu公司),配有泵單元、四元低壓梯度單元、溶劑真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、紫外可見檢測器和CLASS-VP工作站。十萬分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司),數控超聲波清洗器(型號DS-5510D TH,上海生析超聲儀器有限公司)。

甲醇(HPLC純,美國Fisher公司),乙腈(ACN,HPLC純,德國M erck公司),三氟乙酸(TFA,HPLC純,美國Sigm a公司);標準蛋白細胞色素C(cytochrom e C,Cyt-C)、馬心肌紅蛋白(m yoglobin,M Y O)和雞卵白蛋白(album in from chicken egg w hite,ALB)購自美國Sigm a公司;用于色譜柱測試的化合物尿嘧啶、硝基苯、萘、芴為分析純,購自中國醫藥集團化學試劑公司上海分公司;其他試劑均為國產分析純試劑;實驗用水為M illi-Q去離子水。

健康人肝組織樣品由中國人肝組織提供。二硫蘇糖醇(D TT)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和苯甲磺酰氟(PMSF)為Am resco(USA)分裝,購自上海華舜生物工程有限公司。考馬斯亮藍R-250(B io-Rad,USA)。

樣品制備:將人肝組織切成小塊,用冰生理鹽水(0.9%N aCl溶液)清洗3次以除去體液及血液中一些可能的污染物。然后稱重,以1∶8(g∶mL)的比例加入提取液(1mmol/LPMSF,50mmol/L D TT,10mmol/L Tris-HC l,pH7.5),然后置于玻璃勻漿器內進行手動勻漿至組織完全破碎,上述整個勻漿過程在冰浴中進行。勻漿液混旋30m in,在4℃條件下15 000g離心30m in,取上清液即為提取蛋白,-80℃保存備用,蛋白質提取液用B radford法定量。

1.2 實驗步驟

1.2.1 人肝蛋白質樣品的一維WAX分離

蛋白質弱陰離子交換(WAX)柱:Tosoh TSKgel D EAE-5PW(東京,日本),內徑是7.5mm,柱長為75mm,采用10μm,100nm填料,分析柱前加一個2cm長、內徑為4.6mm的保護柱以防止污染或堵塞分析柱,保護柱的填料粒徑為20μm。流動相A:10mmol/L Tris-HC l(pH7.5);流動相B:10mmol/LTris-HC l-500mmol/L氯化鈉(pH 7.5)。流動相流速設定為0.5mL/m in。流動相洗脫梯度為:0%B15m in,于80m in內線性上升至30%B,于22m in內線性上升至100%B,保持5m in,于3m in內降至0%B。上樣量為2m g/次,平行進行3次實驗。收集的餾分經過冷凍干燥后置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 RPLC色譜柱柱效測試

以尿嘧啶、硝基苯、萘和芴為標準物質,分別稱取一定質量的上述4種化合物,以甲醇作為溶劑,配制成1g/L的標準溶液備用。使用時取等體積的上述4種標準溶液混合,并加入30%ACN水溶液稀釋至終質量濃度為0.1g/L。RPLC色譜柱規格:250mm×4.6mm,粒徑5μm,孔徑30nm,硅膠基質,鍵合固定相為C4、C8或C18,購自國內外不同廠家,詳細參數見表1。柱效評價采用色譜柱出廠報告上的色譜條件,樣品進樣體積為5μL。

表1 10支反相色譜柱的參數Table1 Pa ram e te rs of ten RPLC colum ns

1.2.3 標準蛋白質的RPLC分離

分別稱取一定質量的Cyt-C、M Y O和ALB3種標準蛋白質樣品,以去離子水作為溶劑,配制成10 g/L的標準溶液備用。使用時取等體積的上述3種標準蛋白質溶液混合,并加入去離子水稀釋至終質量濃度為1g/L。

色譜條件:流動相A:95%H2O-5%ACN-0.05%TFA;B:95%ACN-5%H2O-0.05%TFA。流動相洗脫梯度為:10m in內由0%B線性上升至25%B,20 m in內由25%B線性升至40%B,8m in內由40%B線性升至80%B,3m in內降至0%B。流速設定為1mL/m in。檢測波長為215nm。樣品進樣體積為30μL。定量方法使用面積歸一化法。

1.2.4 人肝蛋白質WAX餾分的二維RPLC分離

樣品準備:取一定量的一維WAX凍干餾分溶解于1.2.3節RPLC的流動相A相,充分混旋,離心,取上清溶液備用,溶液中蛋白質含量用B radford方法測定,由此確定二維RPLC的上樣量,保證每根色譜柱的分離分析條件的一致性。色譜條件同1.2.3節。

2 結果與討論

2.1 人肝蛋白質樣品的第一維離子交換色譜分離

常用的離子交換色譜柱有陽離子交換柱和陰離子交換柱,陽離子交換色譜通常需在酸性條件下上樣,但在中性溶液中提取的蛋白質經過酸化處理會導致大量蛋白質沉淀,使用陰離子交換色譜則能夠避免蛋白質沉淀。陰離子交換色譜柱有強陰離子交換和弱陰離子交換兩種,在蛋白質分離中應用比較廣泛的是弱陰離子交換色譜柱,因此本研究選擇了兩款弱陰離子交換柱進行比較。如圖1所示,無孔的弱陰離子交換柱TSKgel D EAE-N PR(圖1b)盡管對于一些在大孔弱陰離子交換柱TSKgel D EAE-5PW(圖1a)上強保留的蛋白質分離效果比較好,分離速度也比較快,但色譜柱的樣品容量小,不能滿足二維色譜分離過程中第二維上樣量的需要,因此實驗選取了具有更大上樣量的弱陰離子交換柱TSKgel D EAE-5PW進行人肝蛋白質樣品的第一維分離。通過對梯度條件的優化,最終確定了圖1中使用的流動相梯度條件。1D-WAX餾分收集采用按色譜峰收集的方法,具體如圖2中所示,每次上樣2 m g,重復進樣3次平行收集餾分,然后凍干,置于-80℃冰箱中保存以便進行2D-RPLC色譜條件的考察優化。由圖2也可以看出,在優化后的色譜條件下,3次平行進樣的色譜分離重現性很好。

圖1 不同WAX色譜柱分離人肝蛋白質樣品的色譜圖Fig.1 Chrom a togram s of hum an live r p rote ins with diffe ren t WAX ch rom a tograp hic co lum ns

圖2 人肝蛋白質樣品的一維WAX色譜分離圖Fig.2 Ch rom a togram of hum an live r p ro te ins using1D-WAX liqu id ch rom a tograp hy

2.2 RPLC色譜柱柱效測試

2.2.1 柱效評價

以尿嘧啶、硝基苯、萘和芴為標準物質對色譜柱柱效進行評價。液相色譜系統的死時間以尿嘧啶的出峰時間計,理論塔板數按芴來計算,根據島津LC-2010自帶的工作站CLASS-VP軟件,計算色譜峰的不對稱因子(As)、理論塔板數(NT)和有效塔板數(Neff)等色譜柱參數,具體結果詳見表2。

表2 10支反相液相色譜柱柱效評價Tab le2 Column efficiency evaluation of ten RPLC columns

由上述結果可以看出色譜柱4、9、10的柱效較低,由表1可以看出它們的填料含碳量較低;色譜柱6柱效較高,柱壓降也比較高,可能是色譜柱的填料裝填比較緊密;色譜柱1、2、3、5和8的柱效比較接近,需要比較其對標準蛋白質樣品的分離情況以作進一步的篩選考察。

2.2.2 非特異性吸附考察

硅膠基質的色譜填料具有傳質快、不溶脹、耐高壓等優點。通過在多孔硅膠基質表面鍵合不同的功能基團如氨基、氰基、二醇基、烷基等可以制備具有多種功能性質的色譜填料。反相色譜填料通常是在硅膠基質表面鍵合上不同長度的烷基鏈如C4、C8和C18等,殘余的自由硅羥基使用“封尾”試劑如三甲基氯硅烷(TMSC l)進行烷基化處理,以消除其對樣品分離過程的不利影響。然而隨著烷基化程度的提高,位阻造成的影響使少量硅羥基難以被完全硅烷化,所以不同生產廠家的色譜柱在使用過程中對樣品的非特異性吸附也不同,對于珍貴的人肝蛋白質樣品來講,考察不同填料對蛋白質的非特異性吸附非常重要。

本文采用Cyt-C、M YO和ALB做標準蛋白質進行考察,通過對照空白實驗并利用面積歸一化法對蛋白質在不同色譜柱上的殘留進行計算,結果發現,Cyt-C與M YO在所測試的色譜柱上幾乎沒有殘留,而ALB的殘留相對比較大,這可能與ALB的相對分子質量相對較大而疏水性更強有關,表2給出了ALB的非特異性吸附的數據。可以看出,色譜柱4、7和10的非特異性吸附比較弱;色譜柱6、8和9的非特異性吸附較強;色譜柱1、2、3和5的測試結果比較接近。綜合考慮柱效、柱壓降、蛋白質的非特異性吸附以及色譜柱填料的比表面積、含碳量、使用的pH范圍,選取色譜柱1和2作進一步的研究。

2.3 標準蛋白質與人肝蛋白質WAX餾分的RPLC分離

圖3是RP色譜柱1、2對標準蛋白質樣品Cyt-C和ALB的分離圖,可以看出兩款色譜柱對ALB的分離峰形都比較好;但是對于Cyt-C的分離,色譜柱2具有更好的分離度。

圖3 標準蛋白質樣品Cyt-C和ALB在兩支RP色譜柱上的分離圖Fig.3 Chromatograms of Cyt-C and ALB on two RP columns

之后,實驗選用了1D-WAX的餾分6(見圖2)對兩根色譜柱做進一步的考察。通過色譜圖(見圖4)的比較可以發現保留能力一般的蛋白質樣品在色譜柱1和色譜柱2上具有相似的分離能力;而對于強保留的蛋白質即疏水性比較強的蛋白質,色譜柱2具有更加優越的分離性能。因此色譜柱2(Jup iter300C4,美國Phenom enex公司)被選作人肝蛋白質樣品多維色譜分離的第二維色譜柱。這樣就可以在第一維盡量不損失樣品完整性的基礎上,最大程度地提高蛋白質在第二維的分離效率,不僅可以得到更多中低豐度蛋白質的峰信息,方便地對蛋白質進行定量,還可以簡化后續的液相色譜餾分中蛋白質的復雜程度,提高其質譜鑒定效率。

圖4 人肝蛋白質樣品1D-WAX餾分6在RP色譜柱1和2上的分離圖Fig.4 Chromatograms of1D-WAX fraction6of hum an live r p rote ins on RP column 1 and 2

3 結論

本文系統考察了蛋白質多維液相色譜分離的色譜柱選擇和條件優化。通過分離分析人肝蛋白質樣品選擇了Tosoh公司的具有大上樣量的TSKgel D EAE-5PW色譜柱作為第一維WAX色譜柱;通過對標準樣品和人肝蛋白質樣品WAX餾分的分離條件考察,選擇了美國Phenomenex公司的Jupiter

300C4 反相色譜柱作為第二維RPLC色譜柱,構建了離線的IEC/RPLC二維蛋白質高效分離模式。這對于復雜生物樣品中蛋白質的分離鑒定尤其是中低豐度蛋白質的分離和鑒定是非常重要和必要的。

[1] Mann M,Hendrickson R C,Pandey A.Annu Rev Biochem,2001,70:437

[2] Aebersold R,Mann M.Nature,2003,422:198

[3] Yates J R III.Annu Rev B iophys B iomol Struct,2004,33:297

[4] Dom on B,Aebersold R.Science,2006,312:212

[5] Gygi S P,Corthals G L,Zhang Y,et al.Proc NatlAcad Sci USA,2000,97:9390

[6] Cantin G T,Yates J R III.J Chromatogr A,2004,1053:7

[7] Giddings J C.Anal Chem,1984,56:1258A

[8] Giddings J C.J High Resolut Chromatogr Chromatogr Comm un,1987,10:319

[9] Zhu G J,Liang Z,Zhang L H,et al.Chinese Journal of Chromatography(朱貴杰,梁振,張麗華,等.色譜),2009,27(5):518

[10] Wang Y,Gao M X,Gu X,et al.Chinese Journal of Chromatography(王彥,高明霞,谷雪,等.色譜),2005,23:41

[11] Wang Z C,Zhang Q H,Li T,et al.Science in China Series B:Chemistry(王智聰,張慶合,李彤,等.中國科學B輯:化學),2006,36(1):64

[12] Gao M X,Zhang J,Deng C H,et al.J Proteom e Res,2006,5:2853

[13] Millea KM,Krull I S,Cohen S A,et al.J Proteom e Res,2006,5:135

[14] Sharm a S,Simpson D C,Tolic’N,et al.J Proteom e Res,2007,6:602

[15] Gao M X,Deng C H,Yu W J,et al.Proteom ics,2008,8:939

[16] Wu S,Lourette N M,Tolic’N,et al.J Proteom e Res,2009,8:1347

[17] Gao M X,Guan X,Hong G F,et al.Chinese Journal of Chromatography(高明霞,關霞,洪廣峰,等.色譜),2009,27(5):551

Optimization of two-dimensional high performance liquid chromatograp hiccolumns for highly efficient separation of in tact proteins

HONG Guangfeng1,GAO M ingxia1,Y AN Guoquan1,GUAN Xia1,TAO Q ian1,ZHANG Xiangm in1,2＊
(1.Department of Chemistry,Fudan University,Shangha i 200433,China;2.Institutes of Biomedica l Sciences,Fudan University,Shanghai 200433,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0158-05

＊通訊聯系人:張祥民,教授,博士生導師.Tel:(021)65643983,E-mail:xmzhang@fudan.edu.cn.

國家重點基礎研究發展規劃(“973”)項目(No.2007CB914100/3)、國家高技術研究發展計劃(“863”)項目(No.2006AA02A308)和國家自然科學基金項目(No.20705006).

2010-01-05

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00158