超高效液相色譜法測定飼料中地昔尼爾

農業部畜禽產品質量安全檢驗測試中心（鄭州） 方忠意 劉素梅

地昔尼爾別名丙蟲啶，是一種體外殺蟲劑，對雙翅目昆蟲和蚤有高度殺滅作用，可阻止各種蠅、蚊及蚤的幼蟲發育成蛹和成蟲。但是動物實驗研究結果表明，地昔尼爾對實驗動物鼠具有DNA氧化損傷和致癌作用（Matsumoto等，2009；Umemura等，2007；Moto 等，2006），很多國家已經制定了動物食品中的最大殘留限量。最近發現有非法將地昔尼爾作為飼料添加劑用于飼料生產的現象，直接威脅到食品安全和我國的出口貿易，因此建立飼料中的地昔尼爾的檢測方法，對打擊非法使用藥物、維護我國飼料和畜產品安全有重要的作用。目前國內外很少有地昔尼爾的檢測方法的報道。本研究通過對地昔尼爾化學性質的分析和有關實驗研究，建立了飼料中地昔尼爾的超高效液相色譜測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Lambda 35雙光束紫外光譜儀；Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀 （帶紫外檢測器）；Heraeus離心機。

Waters Oasis MCX 萃取小柱 （3 mL，60 mg）。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨等均為色譜純，其他試劑均為分析純；水為超純水。地昔尼爾對照品購自德國Dr公司（批號為60606）。

1.2 標準曲線溶液的配制 準確稱取地昔尼爾標準品50 mg（精確至0.01 mg）于50 mL容量瓶中，加乙腈超聲溶解，放冷至室溫后用乙腈定容，配制成1.0 mg/mL的標準儲備液；取適量的標準儲備液， 用流動相配制成 0.05、0.1、0.5、1.0、10、50 μg/mL和 100 μg/mL系列標準工作液。

1.3 吸光度的掃描 用乙腈將地昔尼爾標準儲備液稀釋成濃度為10 μg/mL，用紫外分光光度計在200～500 nm掃描地昔尼爾的吸光度。

1.4 樣品處理 準確稱取（2.00±0.02）g已粉碎好的飼料樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩20 min，12000 r/min離心10 min。取5 mL上清液于15 mL離心管中，于50℃下氮吹濃縮至近干后加入3 mL 20%甲醇溶液（含0.2%甲酸），渦旋溶解殘渣，待凈化。將Waters Oasis MCX固相萃取小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化后，加入待凈化的溶液，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗后抽干，用3 mL 5%氨化甲醇洗脫，于50℃下氮吹濃縮至近干。準確加入1.0 mL 30%甲醇溶液溶解，渦旋混勻30 s，過0.22 μm濾膜，濾液供超高效液相色譜儀測定。

1.5 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLCTMHSS T3柱（2.1 mm×100 mm i.d.，1.8 μm）；流動相：甲醇-10 mmol/L 乙酸銨溶液（30+70，V/V）；流速：0.3 mL/min。 檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL。

2 結果與討論

2.1 吸收波長的選擇 在200～500 nm波長范圍內掃描地昔尼爾的吸光度曲線見圖1。從吸光度曲線上可以看出，地昔尼爾有2個吸收峰，其最大吸收波長分別是222.60 nm和270.62 nm。雖然222.60 nm波長的吸光度高于270.62 nm的波長，但是飼料基質復雜，基質的吸收很容易影響地昔尼爾的檢測，所以本研究的檢測波長選擇了270 nm。

圖1 地昔尼爾的吸收曲線圖

2.2 色譜條件的優化 實驗過程中，比較Waters Acquity UPLCTMBEH C18柱 （2.1 mm×10 mm i.d.，1.7 μm） 和 Waters Acquity UPLCTMHSS T3柱（2.1 mm×100 mm i.d.，1.8 μm）發現，地昔尼爾在C18柱保留較差，色譜峰拖尾；但在T3柱有很好的保留，色譜峰對稱性好。對甲醇和乙腈分別作為有機相時的分離效果進行比較，發現使用甲醇時地昔尼爾在色譜柱上保留較好；比較純水、10 mmol/L乙酸銨溶液分別作為水相，發現使用10 mmol/L乙酸銨作為水相時的色譜圖的基線噪音減小，色譜峰峰形得到改善。因此，實驗最終采用“1.5”色譜條件，在該條件下得到的色譜圖。由圖2可知，在該色譜條件下，地昔尼爾色譜峰無雜質峰干擾。

2.3 固相萃取柱的選擇 樣品凈化是對復雜基質樣品檢測過程中的一個重要步驟。從地昔尼爾的分子結構上可以分析出地昔尼爾是一種極性偏強的堿性化合物，實驗過程中比較了C18、HLB和MCX三種不同類型的固相萃取柱的回收率，實驗發現，C18柱的回收率相對較差，這可能是地昔尼爾極性偏強，在C18柱上保留較差；HLB和MCX柱的回收率基本相當，都達到95%以上，HLB柱能夠保留極性化合物，MCX柱能夠通過離子交換作用與地昔尼爾形成強有力的結合。考慮到MCX柱凈化時專屬性更強，凈化效果更徹底，實驗最終選擇了MCX柱。

2.4 方法的線性范圍、檢出限、回收率與精密度取系列混合標準工作溶液，按質量濃度從低到高依次進樣，以質量濃度和峰面積做回歸曲線，得到地昔尼爾的回歸方程為y=41231x-856，相關系數為0.9999，線性良好。在空白飼料樣品中添加地昔尼爾標準溶液進行回收實驗，方法檢出限（S/N=3）為 0.05 mg/kg，定量下限（S/N=10）為0.1 mg/kg。

取地昔尼爾陰性的豬飼料樣品，分別按樣品中10、50 mg/kg和200 mg/kg的含量水平添加一定量的地昔尼爾標準溶液，每一水平做5個平行，按上述試樣方法測定，回收率結果見表1。

3 小結

地昔尼爾質量濃度在0.05～100 μg/mL內線性關系良好，相關系數大于0.9999；在10～200 mg/kg的添加水平，平均加標回收率為78.0%～86.3%，相對標準偏差為4.2%～6.1%；方法的檢出限低至0.05 mg/kg，定量下限低至0.1 mg/kg。該方法簡單、快速、靈敏，可滿足飼料中地昔尼爾的快速篩選檢測的要求。

表1 地昔尼爾的回收率和精密度（n=5）

[1]Matsumoto S，Jin M，Dewa Y，etal.Suppressive effect of Siraitia grosvenorii extract on dicyclanil-promoted hepatocellular proliferative lesions in male mice[J].J Toxicol Sci，2009，34（1）：109 ～ 118.

[2]Moto M，Okamura M，Muguruma M，et al.Gene expression analysis on the dicyclanil-induced hepatocellular tumors in mice[J].Toxicol Pathol，2006，34（6）：744 ～ 51.

[3]Umemura T，Kuroiwa Y，Tasaki M，et al.Detection of oxidative DNA damage，cell proliferation and in vivo mutagenicity induced by dicyclanil，a non-genotoxic carcinogen，using gpt delta mice[J].Mutat Res，2007，633（1）：46～54.