飼用α-半乳糖苷酶穩定性及酶學特性的研究

中國農業大學動物科技學院 王春林 陸文清

α-半乳糖苷酶是消除飼料原料中α-半乳糖苷聚糖類抗營養因子的飼用外源酶類 （張麗英，2000；Leske和 Coon，1999）。但酶在加工應用過程中先經受原料混合加工、高溫制粒、運輸和儲存等環節后，才在動物胃腸道溶解發生作用，所以酶制劑的穩定性倍受關注。α-半乳糖苷酶理化性質的研究對其在飼料中的應用具有指導意義。本試驗對α-半乳糖苷酶粗制品的耐酸、耐溫和耐儲存性能進行了測定，體外研究了動物消化液對酶活力的影響，探討了粗酶-底物作用的動力學特征。

1 材料與方法

1.1 酶樣與酶活測定 酶樣取自青霉菌（Penicillium sp.MAFIC-6）固態發酵生產的α-半乳糖苷酶粗酶制劑，測試樣品為原酶干粉或原酶稀釋液。酶活分析方法參照Wang等（2004）。

1.2 pH對酶活力及穩定性的影響 用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 （pH 3.6 ～ 5.6，0.05 mol/L）、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液 （pH 5.7 ～8.0，0.10 mol/L）、Tris-鹽酸緩沖溶液 （pH 6.8 ～9.2，0.10 mol/L）和 Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液（pH 9.2～10.7，0.10 mol/L）配制pH為2.5～12.5的緩沖體系，測定相同酶液在不同pH條件下的酶活力，確定最適pH。為觀察酶的pH穩定性，用pH 2.5～12.5反應液在40℃分別孵育酶液1、2 h和12 h，再按常規方法測定殘余酶活力。

1.3 溫度對酶活力及穩定性的影響 將酶液置于30～100℃溫度下反應測定不同溫度下的酶活力，確定酶作用的最適溫度。為了解酶在濕熱下的穩定性，將相同的稀釋酶液分別在30～100℃下處理30 min和60 min，冷卻后按常規方法測定殘余酶活力。為了解酶在干熱下的穩定性，用金屬鋁盒稱取干酶粉2.0 g左右，置于30～100℃溫度處理30 min和60 min，冷卻后測定殘余酶活力。結果表示為相對酶活力。

1.4 金屬離子對酶活力的影響 分別配制10×10-3mol/L的金屬離子（見表1）溶液，用酶液混合稀釋使離子在體系中的終濃度為1×10-3mol/L或1×10-4mol/L，于 40 ℃保溫 30 min，然后按常規方法測定α-半乳糖苷酶活力。結果表示為相對于未經金屬離子處理的酶活力的百分比例。

1.5 豬消化液對酶活力的影響 選取6頭體重（20±0.5）kg健康的達蘭豬，屠宰后分別從胃幽門部和小腸空腸部位取內容物，迅速用8層紗布過濾，4℃下4000 r/min離心20 min，取上清液裝棕色瓶-20℃冷凍保存備用。分別用醋酸緩沖溶液（pH 5.5）、胃液（pH 4.0 ～ 4.3）和小腸液（pH 6.1 ～6.3）混合原酶液（V/V 為 9∶1），放置 12 h 和 24 h。其中部分樣品用胃液處理12 h后繼續用腸液處理12 h。最終在統一條件下測定混合液殘余酶活力。以醋酸緩沖液的酶活力為對照，其他酶活與之相比的百分數為相對酶活力。

1.6 酶的耐儲藏試驗 選取起始酶活不同的兩個中試干燥酶樣品 （水分 <8%）。在常溫15～30℃和相對濕度 <50%條件下密封保存9個月，分別在3、6月和9月時取樣測定α-半乳糖苷酶活力，每個樣取6個平行。

2 結果與討論

2.1 pH對酶活的影響 酶的活性受所在環境pH的影響。pH改變能影響酶分子活性部位上有關基團的解離。在非最適pH時，活性基團的解離狀態發生改變，酶底物的結合力降低，因而酶促反應速度降低。此外，環境過酸、過堿能使酶蛋白本身變性失活。酶作為一種活性蛋白質，酶-底物體系的酸堿度影響到酶分子結構域、酶與底物的離子化程度及其間的親和力，一定的解離狀態最適合其催化反應，極端pH條件對酶可引起不可逆的破壞，使酶失活（沈同和王鏡巖，1991）。圖1表明，α-半乳糖苷酶最適pH為4.5。酶在不同pH反應體系中分別保溫1、2 h和12 h后，剩余酶活力呈現了相似的變化趨勢。以pH 4.5的相對酶活力為100%，當pH超過6.5時，3個時間的酶活力均保持在67%左右，隨后酶活迅速下降，到7.5時酶活保持依次為22.46%、20.51%和20.50%，到pH 8.5時，酶活均下降到10.5%以下。在pH 3.5以下時，3個時間點的酶活依次為16.82%、80.18%和53.04%，說明該酶具有較強的耐酸性能。由此可見，該酶的穩定pH在3.5～6.5。

圖1 pH對酶活力及穩定性影響

2.2 溫度對酶活穩定性的影響 酶是一種生物活性催化劑，具有一般催化劑的性質，即其催化效率在一定范圍隨溫度升高而增加，但酶蛋白又會隨溫度升高逐漸變性而喪失催化活性。酶作用最適溫度是這兩種效應的綜合體現。圖2表明，酶的最適溫度在50～60℃。以30℃的相對酶活力為100%，在反應液中，酶在60℃保持30 min和60 min時的相對酶活力仍保持在90.67%和85.95%，但到70℃時，酶活迅速消失。圖3表明，酶在干熱條件下穩定性比濕熱高，超過80℃處理30 min或60 min，酶活仍保持在80%以上，顯然熱處理時間越長，酶活損失越快。因此，認為酶在70℃以下時是穩定的。

圖2 濕熱對酶活力及穩定性的影響

圖3 干熱對酶穩定性的影響

2.3 金屬離子對酶活力的影響 結果如表2所示。在離子濃度較高（1×10-3mol/L）時，各種金屬離子均不同程度地抑制了酶活；在低離子濃度（1×10-4mol/L） 時，Co2+和 Mn2+對酶活力有輕微的促進作用，Zn2+、Sn2+和Ca2+幾乎無影響。兩種濃度的Ag+和Hg2+均強烈抑制了酶活。

表2 金屬離子對酶活力的影響 %

2.4 豬消化液對酶活的影響 表3結果表明，酶經過胃液、腸液和二者連續的處理后，酶活力較對照組均顯著下降（P<0.05），但酶活力在胃液中最高，12 h達90.74%，24 h達86.87%，可能是胃液的pH最接近該酶最適pH范圍的緣故。在小腸液或胃液+小腸液中酶活下降較快，但經過12 h處理仍保持在70%以上。隨著時間延長各處理酶活均顯著降低（P<0.05）。由此證明α-半乳糖苷酶在動物胃腸道內仍能較穩定地發揮活性。

表3 豬消化液對α-半乳糖苷酶活力及穩定性的影響

2.5 儲存時間對酶活的影響 固態發酵的原酶樣，經過3、6個月和9個月的常規儲存后測定α-半乳糖苷酶活力，結果表明（見表4），在0～4℃冷藏9個月酶活力不受影響。在常溫15～30℃保存時，3月之內酶活不受影響，但隨后活力損失顯著（P<0.05），但到6個月時仍保留有原始活力的90.30%，到9個月時有80.58%，可見酶活在儲存條件下比較穩定，能夠適應生產實際中儲存的需要。

表4 儲存時間對酶活的影響

3 小結

通過對α-半乳糖苷酶粗酶制劑的理化性質研究表明，該酶的適宜pH在酸性范圍 （3.5～6.5），適宜的溫度在70℃以下，能夠耐受豬胃腸液12 h，貨架期長。

[1]沈同，王鏡巖.生物化學（上冊）[M].北京：高等教育出版社（第二版），1991.232～328.

[2]張麗英.大豆寡糖對斷奶仔豬抗營養作用及機理的研究：[博士學位論文][D].北京：中國農業大學，2000.

[3]Leske，K L，Coon C N.Hydrogen gas production of broiler chicks in response to soybean meal and α -galactoside free，ethanol-extracted soybean meal[J].Poult Sci，1999，78：1313 ～ 1316.

[4]Wang，C L，Li D F，Lu W Q，et al.Influence of cultivating conditions on the α-galactosidase biosynthesis from a novel strain of Penicillium sp.in SSF[J].Lett App Microb，2004，39：369 ～ 375.