不同培養時間和表皮生長因子濃度對豬卵母細胞體外成熟培養的影響

曲云淼，董振國

（1.黑龍江省家畜繁育指導站，哈爾濱 150069；2.黑龍江省博瑞遺傳有限公司 150069）

豬的克隆和轉基因生產為胚胎工程、品種改良以及醫學組織工程都提供了新的思路，在諸如異體器官移植和生產一些特定的蛋白質等方面具有廣闊的前景。而豬的克隆和轉基因生產等都需要大量成熟的、具有發育潛力的卵母細胞[1]。但是由于豬卵母細胞的生理生化特異性，給克隆和轉基因研究帶來諸多不利因素。因此，需要找到一種理想的豬卵母細胞體外培養方法。影響豬卵母細胞體外成熟的因素有許多，如所處性周期階段、生長因子的作用等。本實驗主要探討了培養時間，以及在培養基中添加表皮生長因子對卵母細胞成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 卵巢的采集和卵泡液的制備

在屠宰場將被屠宰的豬卵巢立即取下，用生理鹽水沖洗干凈，保存于25～35℃含有青霉素（100IU/mL）和鏈霉素（100 IU/mL）的生理鹽水的保溫瓶中，在3 h內運回實驗室。用生理鹽水配制的70%酒精浸泡1 min，然后再用預熱的生理鹽水洗滌卵巢至無血水為止，選擇排卵點多且直徑在2～5 mm卵泡的卵巢，帶進無菌實驗室。

1.2 卵母細胞的采集和成熟培養

使用配有12號針頭的10 mL注射器從2～5 mm卵泡中抽吸卵母細胞，采卵液為TCM-199（Hank's），成熟液為自配成熟液，成份為：TCM-199（Earle's）培養液+0.1%PVA（聚乙烯醇）+3.05 mmol/LD-葡萄糖+0.91 mmol/L丙酮酸鈉+75 mg/mL青霉素+50 mg/mL硫酸鏈霉素，在每次使用之前加入藥品：0.57 mmol/L半胱氨酸，0.5 IU/mL LH，0.5 IU/mL FSH，10μg/mL EGF（表皮生長因子）。將成熟液在培養皿中作成50 μL的微滴，將卵母細胞放入成熟滴在5%CO2、38.5℃、飽和濕度的CO2培養箱中培養44 h。

2 結果與分析

2.1 EGF濃度對豬卵母細胞體外成熟的影響

在自配成熟液作為對照組，分別添加10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL EGF 的成熟液培養COCs（卵丘-卵母細胞復合體），放入5%CO2、38.5℃、飽和濕度的CO2培養箱中培養44 h后，觀察卵母細胞成熟率。

表1 EGF濃度對豬卵母細胞體外成熟的影響

由表1可以看出，添加EGF各組與對照組相比，成熟率都顯著提高，差異顯著。添加EGF各組的成熟率隨著EGF添加濃度的增加也不斷上升。

2.2 不同成熟時間對豬卵母細胞體外成熟的影響

將采集到的可用卵母細胞放入5%CO2、38.5℃、飽和濕度的相同培養條件下分別進行體外成熟培養，培養時間分別為36 h、40 h、44 h和48 h，觀察卵母細胞成熟率。

由表2可以看出，隨著成熟時間的增長，成熟率逐漸增加。

表2 不同培養時間對豬卵母細胞體外成熟的影響

3 討論

3.1 EGF濃度對豬卵母細胞體外成熟的影響

EGF是一種活性物質，由53個氨基組成，通過與特異的、高親和的細胞膜受體結合，調節細胞生長與其他細胞功能等多效應的多肽類物質[1]。Carpenter等報道，它對不同哺乳動物細胞體外培養時都具有很強的促分裂作用。EGF不但能促進卵母細胞減數分裂，也間接調節卵母細胞胞漿的成熟。EGF可以促進卵丘細胞擴張、減少縫隙連接，抑制顆粒細胞合成卵母細胞成熟抑制物（OMI）的作用，促進卵母細胞成熟[2]，也可以參與并促進細胞內的DNA、RNA、蛋白質以及細胞外大分子的生物合成。EGF通過與細胞膜上的EGF受體（EGFR）結合，啟動、催化、維持與細胞生長增殖有關的一系列生化過程。EGF的作用機理可能是與釋放成熟刺激信號阻斷了卵母細胞與卵丘細胞的聯系有關，也可能其直接對卵母細胞產生作用。本實驗結果顯示，所有添加EGF試驗組的成熟率隨著添加量的增加而不斷上升，并且均要高于未添加EGF的試驗組，差異顯著。

3.2 不同培養時間對豬卵母細胞體外成熟的影響

由于動物的種屬差異和個體差異，其體外培養的時間上也是有所差異的。即使同種動物在相同的成熟培養條件下其培養時間也是有所不同的[3]。目前，牛卵母細胞體外培養時間在20～30 h，而豬卵母細胞比較特殊，通常需要48 h左右才能達到核成熟，在24 h的核成熟率幾乎為零。Yoshida認為豬卵母細胞體外培養時間不能低于30 h。30 h之前成熟率隨培養時間增加而迅速上升，30 h后成熟率隨培養時間增加而緩慢上升。豬卵母細胞培養36 h和42 h的成熟率無顯著差異，但顯著低于46 h的成熟率。Sosnowki等對豬卵母細胞體外成熟的培養時間進行研究，結果顯示，培養時間越長成熟率越高，且48 h與36 h之間差異顯著[4]。殷駿等研究了體外培養32～56 h對豬卵母細胞體外成熟的影響，發現隨著時間的延長，第一極體排出率也逐漸增高，但老化率也相應增長。文國藝等也指出，延長培養時間固然可以提高卵母細胞成熟率，但豬的卵母細胞也會逐漸老化。世界首例轉基因克隆豬的成熟培養時間為42～44 h。因此在保證一定的核成熟率的前提下，可以根據自身實驗條件縮短豬卵母細胞體外成熟培養時間。

本實驗結果表明，體外培養48 h卵母細胞的成熟率最高，但與44 h試驗組差異不顯著。因此我們可以將44作為后續實驗中豬卵母細胞體外成熟的培養時間。

[1] 陳大元.受精生物學-受精機制與生殖工程[M].北京：科學出版社.

[2] 李朝軍，范必勤，王金溪.FSH、EGF、胰島素促進小鼠卵母細胞體外減數分裂恢復機制的研究 [J].細胞生物學雜志，1997，01：27-30.

[3] 閆益波，呂善潮，葉紹輝.豬卵母細胞體外成熟培養的主要影響因素[J].浙江畜牧獸醫，2007，32（6）

[4] NamDH，Lee S H，KimH S，et al. The role of gonadotropinreleasinghormone and its receptor in development ofporcinepreim plantation embryos derived from in vitrofertilization [J].Theriogenology，2005，63：190- 201.