RP-HPLC測定拉莫三嗪和苯巴比妥的血藥濃度

杜 軍，李憶軍

（湖南省津市市人民醫院藥劑科，湖南津市 415400）

拉莫三嗪（1amotrigine，LTG）為一種新型的廣譜抗癲癇藥，對部分性發作、GTCS、Lennox-Gastaut綜合征、失神發作和肌陣攣發作有效，臨床上用于難治性癲癇的輔助治療[1-3]。由于其半衰期較長（24～30 h），可以每日1次給藥。苯巴比妥（phenobarbital，PBT）常作為小兒癲癇的首選藥物，廣譜，起效快，對GTCS療效好，也用于單純及復雜部分性發作，對發熱驚厥有預防作用[4-5]，半衰期長達37～399 h。上述藥物的治療范圍窄，且抗癲癇效果、藥物不良反應與藥動學特征有關。為了評價療效或確定給藥方案，使給藥方案個體化，以提高藥物治療水平，達到臨床安全、有效、合理的用藥。因此開展治療藥物監測有重要臨床意義。本研究在文獻[2-6]的基礎上進行改進，采用以氯硝西泮（Clonazepam，CNZ）為內標，建立了HPLC法同時測定兩者的濃度，為臨床合理用藥提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent高效液相色譜分析儀（美國Agilent公司）；低溫高速離心機（德國Beckman公司）；KQ50B型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；XW-80A漩渦混和器（上海醫科大學儀器廠）；電子分析天平（AG285型，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

LTG對照品（批號：051130，葛蘭素史克制藥有限公司，純度：99.5%）；苯巴比妥對照品（批號：171222－200504，中國藥品生物制品檢定所）；內標氯硝西泮（批號：150230-200201，中國藥品生物制品檢定所）；乙腈、甲醇、二氯甲烷均為進口色譜純（美國Tedia公司）；磷酸鉀緩沖液（PBS，北京中杉金橋生物技術有限公司，分析純）；異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentZorbaxXDB-Cl8柱（150mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動相：0.1%乙酸-乙腈；梯度程序為：0.00→7.00 min，A∶B=90∶10；7.00→12.00 min，A∶B=70∶30；12.00→14.00 min，A∶B=90∶10。流速：1.0 ml/min；檢測波長：240 nm；柱溫：40℃；內標：氯硝西泮；結果表明，LTG、PBT和CNZ的保留時間分別約為6.2、10.8和12.7 min，各成分峰形良好，分離完全。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液和內標貯備液的制備

精密稱取 LTG、PBT 和 CNZ 10.0、10.0和 5.00 mg，分別置于25 ml量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容配制成400.0，400.0和 200.0 μg/ml的貯備液。

2.3 樣本采集

清晨患者服藥前抽取靜脈血2 ml，室溫3500 r/min離心8 min，分離并留取血清，置-20℃冰箱保存，待測。

2.4 血樣預處理

冰箱中取出血清，室溫解凍，吸取血清200 μl，置5 ml的離心管中，加入CNZ貯備液 10 μl、乙酸乙酯1 ml，渦旋混合60 s，3500 r/min離心10 min，吸取乙酸乙酯，于40℃用氮氣吹干，加入甲醇溶液100 μl溶解，精密吸取取20 μl進樣。

2.5 線性關系考察

2.5.1 標準血樣 精密量取“2.2”項下貯備液適量，用甲醇溶液稀釋，加入適量空白人血清，制成含 LTGl.0～50.0 μg/ml、PBT 1.0～150.0 μg/ml的系列濃度標準血樣。

2.5.2 線性試驗 取 “2.5.1” 項下含 LTG分別為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/ml，含 PBT 分別為 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、150.0 μg/ml的標準血樣，按“2.4”項下方法處理，進樣測定，分別以樣品與內標的峰面積比Y對濃度C線性回歸，得 LTG 標準曲線為：Y=0.1739C-0.0221（r=0.9991）；PBT標準曲線為Y=0.2105C+0.0337（r=0.9990）。表明血清中 LTG 在 1.00～50.00 μg/ml和 PBT 在 1.0～150.0 μg/ml的濃度范圍內線性關系良好。

2.6 回收率和精密度實驗

取人空白血清200 μl，分別加入LTG和PBT對照品工作液，配成濃度為 2.00、20.00和 40.00 μg/ml和濃度為 5.0、20.0和50.0μg/ml的標準血清。按“2.4”項下方法操作，分別測得兩藥物的回收率及日內、間精密度，結果見表1。LTG及PBT的平均回收率均＞97.0%，日內精密度＜4.3%，日間精密度＜5.4%。

2.7 干擾實驗

在此色譜條件下，苯妥英鈉和卡馬西平的保留時間分別為15.1 min和21.3 min，對兩種藥物峰及內標峰均無干擾。用本法監測的56例樣品中，亦未見有其他峰干擾。

2.8 人體血樣測定

本法用于數例患者服藥達穩態后（門診患者兩藥均服用1個月后），血清中藥物谷濃度（清晨抽取服藥前患者空腹血）的測定，患者血清色譜圖見圖2。

表1 拉莫三嗪、苯巴比妥回收率和日內、日間精密度及回收率Tab.1 Recovery，precisions of intra-day and inter-day of lamotrigine and phenobarbital

3 討論

3.1 兩種藥物的結構及藥理作用

LTG是一聯苯三嗪衍生物，為抗癲癇新藥，通過作用于鈉離子通道，抑制興奮型神經遞質的釋放，從而達到藥理活性[7]，近年來已成為血藥濃度檢測的目標藥物。PBT是苯巴比妥（Phenobarbital，PBT）為嘧啶類衍生物，為 GABAA受體激動劑，作用于巴比妥酸位點而增加Cl-的傳導[8]。癲癇的治療一般主張單藥治療，但對于難治性癲癇往往采用聯合用藥作用于不同靶點而發揮療效[9]。常用的抗癲癇藥物由于其治療指數小，個體差異大往往需監測合并使用的抗癲癇藥的血藥濃度。文獻[3]有對上述兩種藥物含量同時測定的報道，但對測量儀器的配制要求較高，一般醫療單位不具備條件。本研究采用梯度洗脫法對化學結構、理化性質差別較大的成分進行較理想分離并對其含量測定。

3.2 波長的選擇

文獻[3]報道LTG在214 nm波長處吸收最大，可提高LTG測定的靈敏度，但本法采用了240 nm的波長，目的是為了兼顧PBT的含量測定，減少基線的飄移和雜質峰的影響，完全滿足臨床上檢測的需要。

3.3 內標的選擇

文獻[6]報道LTG的含量測定中采用氟西泮作為內標物，PBT的含量測定[7-9]采用艾司唑侖為內標物。本實驗曾嘗試用到該兩種化合物作內標，但在該色譜條件下與目標峰分離效果不理想，后選用氯硝西泮，考慮到三者具有較理想的分離度，且峰位又不與其他抗癲癇藥物及內源性物質重疊，故本研究選擇氯硝西泮作為兩藥物含量同時測定的內標物。

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