誘導多能干細胞(iPS)的誘導培養與鑒定

成德，雷蕾，盧智娟，李珍，王華巖

西北農林科技大學動物醫學院 陜西省農業分子生物學重點實驗室 陜西省干細胞工程技術研究中心，楊凌 712100

誘導多能干細胞(iPS)的誘導培養與鑒定

成德，雷蕾，盧智娟，李珍，王華巖

西北農林科技大學動物醫學院 陜西省農業分子生物學重點實驗室 陜西省干細胞工程技術研究中心，楊凌 712100

通過外源轉錄調控因子的誘導，使成體細胞重編程為胚胎干細胞(ES細胞)樣的多能細胞，這種細胞稱為誘導多能干細胞(iPS細胞)，這一方法被稱為iPS技術。目前，iPS技術已先后在小鼠、人、獼猴、大鼠和豬中成功應用，建立了相應的iPS細胞系，并獲得了iPS細胞嵌合小鼠和四倍體克隆小鼠。盡管iPS與ES細胞在形態和生長特性上有許多相同之處，但iPS細胞的建立需要較獨特的誘導培養體系和鑒定方法。以下結合近年來iPS技術的發展和本實驗室的相關研究，對iPS細胞的建立和培養體系的優化進行了深入探討。

誘導多能干細胞，轉錄因子，細胞重編程，誘導，胚胎干細胞

Abstract:The somatic cells can be induced into ES-like stem cells when retrovirally infected the defined transcription factors including Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc.These ES-like cells are named induced pluripotent stem(iPS)cells and this method is called iPS technology.Until the end of 2009, iPS cell lines have been generated in various animal species, such as mouse, human, rhesus monkey, rat and pig.Mouse iPS cells are also used to generate chimera mice and viable mice through the tetraploid complementation.Although iPS cells are extremely similar to ES cells in both morphology and growth features, to generate iPS cells do need the defined culture procedures.Based on the update global iPS technology development and the iPS studies in our laboratory, this paper focused on the establishment of iPS cell lines and improvement of iPS cell culture condition.

Keywords:iPS, transcription factor, reprogramming, induction, embryonic stem cell

1981年，Evans等[1]成功分離出第一株小鼠胚胎干細胞。至今，胚胎干細胞已成為生命科學領域的熱門話題。尤其是人類胚胎干細胞的成功建系為再生醫學的研究開辟了新的途徑，但是免疫排斥和倫理道德問題給胚胎干細胞在臨床應用上帶來了很大的困擾[2]。1997年，克隆羊多莉的誕生使科學家認識到，通過卵母細胞中的母源性表觀遺傳修飾可以使成體細胞重編程為多能干細胞[3]。這種用體細胞核移植技術進行細胞重編程的研究，由于對設備條件要求高，操作技術復雜，阻礙了該技術的廣泛應用[4]。另外一種進行細胞重編程的技術是將成體細胞與胚胎干細胞進行細胞融合，使融合后的成體細胞恢復多能性，但是融合細胞由于核型異常等問題難以應用于臨床上[5-6]。2006年，通過對卵母細胞和胚胎干細胞中涉及細胞重編程的細胞因子的深入分析和研究，日本科學家Takahashi和Yamanaka研究小組利用 4個基因轉錄因子，成功在體外將成體細胞誘導成為胚胎干細胞樣的多能干細胞，并將其命名為誘導多能干細胞(iPS細胞)，而產生iPS細胞的方法稱為iPS技術[7]。

1 iPS細胞誘導

2006年，日本京都大學 Yamanaka(山中伸彌)教授所率領的研究小組篩選出了 4個在胚胎干細胞或腫瘤細胞中高表達的基因轉錄因子(Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc，OSKM)，并利用逆轉錄病毒載體將這些因子轉染到小鼠成纖維細胞中。通過這些因子在受體細胞內過量表達，誘導成纖維細胞去分化，使成體細胞重編程為多能干細胞，并將其定義為誘導多能干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)[7]。iPS細胞的主要特征表現為：能夠形成ES細胞樣的集落，胞核較大核質比高，堿性磷酸酶(AP)染色呈陽性，表達內源性Oct4、Sox2和Nanog，端粒酶活性提高，能在裸鼠體內形成畸胎瘤等。經基因芯片分析，iPS細胞的基因表達譜與ES細胞相類似，而與誘導之前的受體細胞明顯不同。在小鼠嵌合試驗中，對胎兒進行切片染色，證明 iPS細胞在生殖系中嵌合成功[8-11]。

最初獲得小鼠 iPS細胞的效率很低，所采用的技術手段也存在缺陷，例如采用Fbx15基因作為誘導標記、在誘導過程中采用藥物篩選等。因此，有研究者甚至懷疑 iPS細胞是生物體內殘留的極少量干細胞經外源基因的誘導激發而產生的多能細胞。但最近幾年，iPS技術得到了迅速發展，產生了不同的iPS誘導技術，例如采用Oct4/Sox2/Nanog/Lin28(OSNL)因子誘導等。至今為止，小鼠、人、獼猴、大鼠、豬等物種都已建立了iPS細胞系[7,12-15]。而且通過四倍體囊胚嵌合技術，證實了小鼠 iPS細胞能發育成為完整的小鼠個體[16]。目前，iPS技術已迅速向醫學臨床應用方面展開，特別是在病理模型方面進展顯著，已建立了十多種人類疾病模型的 iPS細胞株[17-18]。不過要將 iPS技術應用于臨床，還存在如誘導效率低和致瘤性等尚待解決的問題[19]。

誘導iPS細胞產生的技術手段，主要有如下幾種：

1.1 采用載體誘導

最初為了使導入的外源基因能在受體細胞內持續表達，保證 iPS誘導的成功，采用了能高效整合的反轉錄病毒和慢病毒為載體。但是病毒載體在受體細胞基因組中高效隨機的整合也使得到的 iPS細胞具有很高的致瘤性。為了解決這一問題，又改用基因整合能力低的腺病毒作為載體進行誘導，雖然誘導效率明顯降低，但最終成功得到了沒有病毒整合的 iPS細胞[20]。而日本一研究小組采用普通質粒作為外源因子的導入載體，也成功誘導得到了 iPS細胞。但是與前者類似，誘導所用的時間要加長，且效率很低[21]。上述這些降低病毒副作用的方法，使iPS技術向臨床應用邁進了一大步。

以上研究雖然避免了病毒在iPS細胞中的整合，但是極低的誘導效率極大地阻礙了其在實際研究中的應用。對此，部分研究小組利用 Cre/LoxP系統[22-23]、oriP/EBNA1載體[24]及 piggyBac轉座系統[25]等，將外源基因整合到受體細胞中誘導iPS，然后再將外源基因從 iPS細胞的基因組中切除，從而得到不含外源基因整合的iPS細胞。

此外，隨著研究的深入，所需的轉錄因子的數量也越來越少，最初篩選出的4個轉錄因子為OSKM和 OSNL。在隨后的誘導研究中發現可省去具有致瘤性的c-Myc因子，雖然對于誘導的時間和效率有一定的影響，但在很大程度上降低了 iPS細胞的致瘤性[26]。而誘導本身具有一定多能性的成體干細胞，只需更少的誘導因子就能得到iPS，如以神經干細胞為受體細胞進行誘導，只要轉染Oct4單個基因就能成功得到iPS細胞[27]。

1.2 采用小分子化合物誘導

最初iPS細胞誘導的效率只有0.01%左右。為了提高誘導效率，研究者發現在誘導過程中在培養基中添加小分子化合物，如：2-丙基戊酸(Valproic acid，VPA)、5-氮雜胞苷(5-AZA)、G9a 組蛋白甲基化轉移酶抑制劑(BIX01294)、鈣通道激動劑(BayK8644)等，能促進受體細胞的重編程，顯著提高 iPS的誘導效率[28-31]。這些小分子有的是通過抑制基因組甲基化作用，直接提高受體細胞被誘導的效率；有的則通過影響特定的信號通路，使誘導過程中產生的中間過渡型細胞和部分重編程的細胞轉化為穩定的完全的多能干細胞。添加小分子化合物的誘導方法，使一些低效率的誘導技術，例如蛋白質因子誘導 iPS的克隆形成率明顯提高[32]。小分子化合物誘導劑的出現，對 iPS技術走向臨床應用起到了顯著的推動作用。目前，越來越多的小分子化合物被發掘出來，2009年底報道的維生素 C促進iPS細胞形成就是一例[33]。人們期待，將來能夠實現完全采用小分子化合物誘導得到的iPS細胞。

1.3 采用蛋白質分子誘導

為了避免病毒和外源基因對得到的 iPS細胞產生的影響，研究者直接采用以上 4個轉錄因子的蛋白質對受體細胞進行誘導[32,34]。但是由于蛋白質在細胞內不穩定，不能持續作用，因此需要對受體細胞進行多次的蛋白處理。Zhou等采用隔天多次將受體細胞與外源蛋白進行共培養的方法，通過特定的信號轉導肽將其運送至受體細胞核內發揮作用，通過4輪蛋白因子的處理，再結合VPA的輔助，才最終成功誘導得到iPS克隆[32]。而Kim等則采用穩定表達四因子融合蛋白的HK293細胞的裂解產物誘導人成纖維細胞，可最初連續 6 d的誘導處理卻引起受體細胞的死亡；隨后通過16 h的蛋白誘導處理與新鮮培養液培養6 d相結合，進行反復6輪誘導之后才最終得到了 iPS克隆[34]。與之前的實驗相似，蛋白質分子誘導 iPS細胞的效率極低，且所需時間很長。因此，這種方法還需要進一步地探索才有可能在實驗中廣泛應用。其中特別要解決的問題，一個是體外大量制備高純度的蛋白因子，另一個是使蛋白因子有效地轉運進入細胞內。這兩個問題的解決將會使這一方法得到有效的應用。

1.4 采用siRNA誘導

與小分子化合物誘導相類似，在四因子誘導的基礎上加入對 RNA翻譯水平起特定調控作用的siRNA也同樣能提高iPS的誘導效率，如p53基因的 siRNA、Utf1基因的 cDNA、Wnt3a等。研究發現，它們均可以通過影響與細胞分化和多能性維持相關的一些信號通路，從而促進誘導過程中受體細胞的重編程，提高 iPS誘導效率，或替代某些誘導因子的使用[36-37]。目前。采用這一方法誘導 iPS的報道還不太多，研究人員還在尋找更多有效的siRNA干擾片段。

2 iPS細胞誘導培養體系

iPS細胞的誘導培養就是將分化的受體細胞重編程為多能細胞的過程。進行 iPS細胞誘導主要涉及以下幾個技術要點：

2.1 受體細胞的選擇

iPS技術雖然在不同物種的多種細胞上都取得了成功，但是不同的受體細胞、不同的細胞狀態及其傳代代數，對于誘導的效率，甚至誘導是否能取得成功都有一定的影響。因此，在實驗之初需準備符合要求的受體細胞。

最初，研究者以胎鼠和成年小鼠的成纖維細胞為受體細胞進行 iPS誘導，雖然最終都得到了 iPS細胞，但是采用胎兒細胞進行的誘導效率明顯要高一些[7]。這可能是由于胎兒細胞增殖活力強，并且甲基化程度較低，易于重編程。

隨后，以小鼠肝臟細胞、胃表皮細胞、胰腺 β細胞，甚至成熟的B淋巴細胞作為受體細胞進行iPS誘導也都取得了成功[38-40]，這充分說明了 iPS技術的普遍適用性，也證明了各類體細胞都具有被重編程為多能性細胞的潛能。研究發現不同類型細胞來源的 iPS細胞具有不同的特點，如肝臟細胞和胃上皮細胞來源的 iPS細胞其基因組不易被病毒整合，具有較低的致瘤性[38]，更適合于醫學研究的需要。Aasen等也發現以角質細胞作為受體細胞可顯著提高 iPS的誘導效率，并能降低病毒在受體細胞基因組上的整合[41]。另外，神經干細胞本身表達較高的內源性Sox2等因子，當采用Oct4一個因子時，也能產生較高效率的 iPS細胞。因此，神經干細胞可以作為理想的受體細胞[42-43]。

不同受體細胞對于誘導效率的差異至今仍沒有確切的解釋，但是從 iPS誘導的過程可以認為，這可能是由于不同受體細胞間的表觀遺傳修飾的差異引起的。不同細胞基因組的甲基化和乙酰化程度各不相同，誘導重編程過程中開啟外源基因表達的要求也不一樣，如誘導過程中添加甲基化酶抑制劑可以明顯提高誘導的效率。同時，有的受體細胞自身也表達部分的誘導因子，這不僅可以減少外源基因的使用數量，同時也減輕了重編程的負擔，進而可以得到較高的 iPS誘導效率，且減少誘導的時間，例如神經干細胞誘導為iPS細胞。

由于取材和培養簡便，原代成纖維細胞仍然是iPS誘導中最常用的受體細胞。同時，為了確保受體細胞的增殖活力，盡可能使用低代數(3～5代)的原代細胞進行誘導[44]。不同類型受體細胞用于 iPS誘導的結果見表1。

2.2 誘導培養條件

誘導iPS細胞的主要培養操作流程見圖1，具體分為以下幾個步驟完成：

表1 用于iPS誘導的受體細胞類型Table 1 Recipient cells used in iPS cell induction

圖1 豬iPS細胞誘導培養時間流程Fig.1 The procedure of reprogramming porcine somatic cells to iPS cells.(A)The morphology of the porcine fibroblasts before virus infection.(B)The morphology of porcine fibroblasts changed after 6 days after virus infection.(C)The ES-likes colony of the porcine iPS 13 days after virus infection.

2.2.1 外源轉錄因子導入

iPS誘導的起始是將外源基因或者外源基因的表達產物導入受體細胞內，使其在受體細胞內啟動早期胚胎基因組的轉錄表達。所用的外源基因以OSKM為主，同時增加 Nanog和line28將有助于提高誘導效率[47]。

常規的操作是通過病毒載體攜帶外源基因轉染受體細胞，轉染時間為24～48 h，可進行第2次轉染以提高轉染效率。為了保證轉染效率，病毒的滴度要求達到 1×106～5×106以上，病毒轉染的當天為誘導0 d。轉染后撤去病毒液，用新鮮的受體細胞培養液繼續培養 24～72 h[44,48]。然后將轉染的細胞鋪于MEF或SNL細胞飼養層上，在六孔板上細胞的密度為每孔5×104個細胞。生長24 h后，換上ES培養液繼續培養。但也有人認為，病毒轉染后的細胞不更換新鮮培養液，直接消化后接于明膠鋪底的培養板上可以提高誘導效率，且不需要飼養層的支持，這也是誘導過程中認為不需要飼養層的唯一報道[31]。對此，本實驗室在研究中發現以上兩種處理之間的差異并不顯著，在較短時間內的誘導并不依賴飼養層細胞的支持。對于神經干細胞等能在較短時間內誘導出現 iPS集落的受體細胞，可以在病毒轉染后直接換上ES培養液，而不進行消化重鋪，在出現集落之后再將集落單獨接種于飼養層上，進行下一步的傳代誘導培養[43]。

采用逆轉錄病毒或慢病毒進行誘導[7,47]，會導致iPS細胞具有較高的致瘤性，為此可利用普通的質粒或不整合的腺病毒等作為外源基因的導入載體。鑒于質粒轉染效率低，持續表達時間短，因此需要反復多次對受體細胞進行轉染[20-21]。如用質粒進行外源基因的導入，研究者將Oct4、Sox2、Klf4三個基因整合到一個載體上，實現其共表達。轉染時將該質粒載體與帶有c-Myc的質粒載體共轉染，或者反復交替地分別單獨轉染，轉染要分別進行3輪以上，持續 1周左右，從而實現外源基因的高效導入和持續表達，但最后得到iPS克隆的效率不到0.001%。

同時，外源基因對受體細胞的誘導重編程似乎不局限于同一物種內，異源轉錄因子同樣可以誘導受體細胞成為 iPS細胞[14]。可能由于多能性轉錄因子在不同物種之間具有很高的保守性，可以調控異種受體細胞基因的表達，從而啟動重編程過程。這在早期異種動物核移植的研究中也可以印證，但是由于孕期的差異，個體發育特異性和核質相容等差異，至今未能成功得到異種克隆動物。

2009年初，有兩個研究小組分別用四因子表達的重組蛋白誘導小鼠和人成纖維細胞成為iPS細胞。研究者將 4種蛋白質因子帶上信號肽，將其添加到培養基中與受體細胞共培養12 h，然后換上新鮮培養液培養36 h，再添加蛋白質因子，依次重復4輪，需9 d左右。然后將細胞重鋪到飼養層上繼續培養，并且在誘導培養液中添加甲基化酶抑制劑VPA[32]。而另一研究小組則對受體細胞進行 7 d一次的蛋白處理，并且反復誘導6輪，最后才得到iPS細胞[34]。與質粒誘導的方法相類似，采用蛋白因子誘導 iPS的效率很低，小于0.001%，且時間約為病毒誘導的2倍左右。

2.2.2 誘導后受體細胞的培養

由于誘導 iPS細胞的過程較長，所以，在外源因子導入細胞后，掌握好對被誘導的受體細胞進行長期的體外培養至關重要。將導入外源基因或其表達產物后的受體細胞接于飼養層后，第 2天換成相應的ES細胞培養液，之后每隔24～48 h換液，直至ES樣克隆出現，該過程一般需要15～20 d[44,48]。有報道稱，誘導時間至少需要在10 d以上，不然產生的 iPS細胞可能不具有完全的多能性[49]。但更多的研究顯示，克隆出現的時間與受體細胞的年齡和轉染因子的數量有關。一般胎兒細胞要比成體細胞出現克隆早，上皮樣細胞所需的誘導時間要比成纖維細胞短一些，而以神經干細胞為受體細胞則僅僅只需要3～5 d就可以出現大量的ES樣克隆[43]。本實驗室用豬成纖維細胞為受體細胞誘導豬iPS(圖1)，在攻毒后4 d，受體細胞的生長速度明顯加快，6 d左右受體細胞會發生明顯的形態改變并出現極小的ES 樣克隆，至 13～15 d，克隆已長到 100～200 μm 大小，可以對其進行傳代培養。而導入較多的轉錄因子，如導入6個轉錄因子(OSKMNL)，同樣可以縮短克隆出現的時間，并提高誘導的效率[50-51]。此外，在誘導培養過程中添加甲基化酶抑制劑等小分子化合物也可以提高誘導的效率，縮短誘導時間[35]。

受體細胞在導入了外源基因后會明顯加快增殖速度，4～6 d之后則會發生明顯的形態改變[14]。在誘導過程中發現，受體細胞往往會在ES樣克隆出現之前便已長滿整個培養皿，這時需要對其進行傳代，盡管有報道稱誘導過程中傳代會影響誘導的效率[31]，但是不及時傳代將會導致受體細胞大量死亡。在連續傳代過程中，應盡量采用Ⅳ型膠原酶進行細胞消化，這樣可以除去傳代過程中飼養層的干擾[48]。

為了便于誘導和篩選，受體細胞可以帶上篩選標記或報告基因。早期的iPS誘導均采用了抗性篩選，即將新霉素基因(neo)插入到Fbx15等胚胎干細胞特異表達基因的啟動子后面，并在誘導過程中添加 G418進行篩選，最后得到 ES樣的多能性細胞[7]。后來，研究認為iPS誘導是一個漸進的過程，而多能性基因表達的開啟需要一定的時間，在誘導時利用藥物篩選可能會殺死部分潛在的重編程細胞，從而降低了誘導效率。因此，以后都改用由Oct4或 Nanog啟動子驅動的綠色熒光蛋白(GFP)作為報告基因[35,39]，因為以Oct4和Nanog多能性基因篩選得到的iPS細胞較Fbx15篩選得到的iPS細胞更接近ES細胞[11]。

從以上不同的誘導方法中可以看出，外源因子對受體細胞重編程的誘導并不依賴于外源基因對受體細胞基因組的整合，也不依賴于外源基因本身。只要能夠促進受體細胞在復制過程中開啟多能性基因的表達即可。而且受體細胞的誘導重編程是一個循序漸進的過程，需要大約10～15個細胞倍增時間。由于逆轉錄病毒和慢病毒可在受體細胞內持續表達，因此以其為載體才有較高的誘導效率。而普通質粒，尤其是蛋白質的誘導，對受體細胞的誘導作用均是瞬時性的，因此才需要反復多次的轉染或共培養，從而達到維持一定時間的誘導的目的。且誘導的效率也明顯要低得多，需要更長的誘導時間[32,34]。

2.2.3 iPS細胞的傳代培養

當原代的iPS克隆長到100～200 μm時，需要對iPS克隆進行傳代，接種到新的飼養層上進行增殖培養。早期傳代時，主要采用機械法，將克隆單個挑取，分別消化，再接種到鋪有飼養層細胞的96孔板中。等繼代克隆傳至 5～6代之后，便可以采用Ⅳ型膠原酶消化法對其進行傳代培養。從96孔板開始，依次逐漸放大擴增直到接種在60 mm培養皿上。在得到足夠細胞量之后將其分別凍存，這樣可以保證iPS細胞遺傳背景的一致性。本實驗室經過3次傳代將單個克隆的 iPS細胞傳代至六孔板中，待其長滿之后便將其部分凍存，之后消化傳代的方法基本與ES細胞培養方法相同。挑取較好的克隆之后剩下的細胞克隆通過堿性磷酸酶(AP)染色，計數，計算誘導的效率。

如果受體細胞有GFP等篩選的報告基因，那么可以直接挑取GFP陽性克隆。也有報道通過流式技術將誘導一定時間的GFP陽性細胞先篩選富集，再進行傳代培養[43]。但是如果誘導的時間較短，有可能 GFP的報告基因要在傳代之后才慢慢呈現陽性，而克隆的形態也會在傳代過程中慢慢變得更為典型[10]。

此外，誘導過程中還會產生較多不具有多能性的ES樣克隆，這類細胞在形態上與多能性iPS細胞相類似，同樣呈集落樣生長，增殖很快。但該類細胞AP檢測大多呈陰性，內源多能性基因表達較低，甚至不表達，而c-Myc等致瘤基因則表達很高。這可能與外源基因的導入和整合的隨機性有關，部分因子的缺失或表達的不一致，引起受體重編程的不完全所致[10]。

2.3 iPS細胞的表觀遺傳學檢測

誘導得到的iPS細胞一般需要以相應物種的ES細胞為參照標準，從分子、細胞和動物個體水平對其進行系統的檢測。包括其多能性細胞特異的標志基因的表達情況，向 3個胚層分化的潛能和自我更新能力，此外還涉及外源基因的沉默，及 iPS明確的遺傳背景。

2.3.1 分子水平

在分子水平上，iPS細胞中導入的外源基因表達水平要隨著重編程的完成逐漸降低或沉默，內源的多能性基因表達激活，基因的選擇以ES細胞表達的特異性標志為參照。如通過RT-PCR檢測Oct4、Sox2、Nanog、Rex1、SSEA1、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81等基因的表達情況[7,13]。且此類基因在不同物種間的表達不完全相同，如小鼠的iPS一般SSEA1呈陽性，SSEA3、SSEA4呈陰性。而人的iPS細胞則正好與之相反，SSEA1為陰性，SSEA3和SSEA4為陽性[52]。此外，為了明確 iPS細胞的永生化能力，

還需檢測其端粒酶活性。

iPS細胞由體細胞誘導而來，故還涉及檢測其遺傳背景的問題，需通過微衛星技術進行指紋鑒定，要求與受體細胞一致。如受體細胞內整合有GFP等報告基因，則亦可以作為其遺傳背景的有力證據[7]。同時，還需檢測 iPS細胞中內源的多能性基因啟動子的甲基化水平，如Oct4和Nanog是最常用的檢測對象。這些基因的啟動子在成體細胞中是高度甲基化的，而在誘導為 iPS細胞后則去甲基化，與相應的ES細胞相一致，這也是內源多能性基因表達開啟的檢測指標之一[7]。

此外，還需檢測iPS細胞整體的基因表達水平，一般采用基因芯片進行檢測。之前的研究顯示，iPS細胞的基因表達譜與誘導前的受體細胞明顯不同，而與ES細胞相類似。特別是部分多能細胞中特異表達的基因，在iPS細胞中的表達幾乎與ES細胞相同[53]。但是，不同批次的iPS細胞，甚至同一批次的不同克隆之間，其基因圖譜均有一定的差異。因為多能性誘導是極其復雜的重編程過程，外源基因導入的隨機性及其表達之間的差異，誘導時間的長短，均會引起最后產生的 iPS克隆的具體性質及整體基因表達譜上的差異[10]。

2.3.2 細胞水平

細胞水平需檢測的是 iPS的多向分化潛能和體外自我更新的能力。所得到的 iPS細胞首先形態上要與 ES細胞相類似，具體表現為細胞呈集落樣生長、集落致密且邊緣整齊、細胞形態較小、核質比高、增殖迅速、倍增時間短、能夠長期傳代。iPS細胞經 AP染色鑒定，要求呈陽性，還需進行多種轉錄因子及細胞表面標志的免疫熒光染色及流式細胞技術的分選，如：Oct4、Nanog、SSEA1、SSEA3等。完全重編程的 iPS細胞應具有體外分化潛能，能夠分化為各個胚層的不同類型的細胞，如外胚層的神經細胞、上皮細胞、軟骨細胞等；中胚層的肌肉細胞、脂肪細胞等；內胚層的肝細胞、胰島細胞等。此外，還需檢測 iPS細胞的核型情況，由于外源基因整合的隨機性，使誘導得到的 iPS細胞會有較高比例的核型異常，那些核型異常的 iPS細胞，應予以剔除。

2.3.3 動物水平

除了要在分子和細胞水平上對 iPS細胞進行嚴格的檢測之外，還要求在動物體內進行其多向分化能力的檢驗。首先要求對iPS細胞在免疫缺陷鼠(如SCID Beige 小鼠)體內進行成瘤實驗。將 1×106～5×106iPS細胞注射到裸鼠的皮下，經過一段時間的生長，來觀察皮下畸胎瘤形成的變化。根據動物來源的不同，iPS細胞成瘤時間也不盡相同，如小鼠的iPS細胞約在1個月左右能成瘤，但是豬的iPS細胞需要1～3個月時間才能成瘤[54]。取出的瘤組織，經切片檢測其是否發育出3個胚層的各種組織。同時，在條件及倫理道德允許的情況下，還應將 iPS細胞在相應物種上進行嵌合體實驗，要求后代能夠真正實現生殖系嵌合[11]。但與 ES細胞類似，由于倫理道德等問題的限制，這一指標至今仍只在小鼠上獲得成功。最近有研究報道，小鼠 iPS細胞通過與四倍體囊胚嵌合，成功生下具有正常生殖能力的完全由 iPS細胞發育而來的小鼠，這充分說明了 iPS細胞具有發育為完整個體的能力[16]。

3 展望

iPS技術的誕生將干細胞研究推進到了一個新的高度，極大豐富了干細胞的研究內容。在過去 3年里，iPS技術發展迅速，先后已在小鼠、人、獼猴、大鼠和豬中取得了成功。而且早期 iPS技術上遇到的難題和困擾，如病毒載體、致瘤基因、誘導效率、iPS全能性等都一一得到了解決。特別是在小鼠和人上的 iPS研究日益深入，誘導的方法也不斷得到優化，動物機體組織的各種細胞均可被誘導為 iPS細胞。由于iPS細胞具有與ES細胞相類似的特性和功能，盡管還不能完全代替ES細胞，但是其成功地繞開了免疫排斥問題和倫理道德問題的困擾，是再生醫學理想的種子細胞，也可作為臨床藥物篩選細胞模型和人類疾病治療細胞模型。此外，由于 iPS細胞可在體外長期穩定地傳代培養，是轉基因技術中理想的種子細胞，用作基因打靶受體細胞，在轉基因動物的生產上有著廣闊的應用前景。特別是對于至今仍沒有ES細胞建系的物種，iPS細胞有可能成為其ES的代替細胞應用于科學研究和生產實際。

當然，目前iPS技術還不是十分完善，對于誘導的機理也沒有完全研究清楚，尤其是誘導過程中產生的大量類 iPS細胞或不完全重編程細胞的干擾，使得真正具有全能性的iPS難以被很快篩選得到。但是相信隨著研究的不斷深入，iPS技術將會更加成熟，iPS細胞將會在生命科學領域發揮更大的作用。

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Induction and characterization of induced pluripotent stem(iPS)cells: a review

De Cheng, Lei Lei, Zhijuan Lu, Zhen Li, and Huayan Wang
Shaanxi Key Laboratory of Agricultural Molecular Biology, Shaanxi Center for Stem Cell Engineering and Technology, College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, China

Received:October 29, 2009;Accepted:March 2, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.30871786), High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2008AA101005), National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2009CB941002).

Corresponding author:Huayan Wang.Tel: +86-29-87080069; E-mail: hhwang101@163.com國家自然科學基金項目(No.30871786)，國家高技術研究發展計劃(863計劃)(No.2008AA101005)，國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(No.2009CB941002)資助。