乙型肝炎病毒核心蛋白作為表位疫苗載體的應用

殷瑛，徐俊杰，陳薇

軍事醫學科學院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

乙型肝炎病毒核心蛋白作為表位疫苗載體的應用

殷瑛，徐俊杰，陳薇

軍事醫學科學院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein，HBc)可以形成二十面體對稱的顆粒樣結構，由于其N端、C端和主要免疫顯性區域(Major immunodominant region，MIR)允許一定程度的缺失和外源插入，并且能夠將外源序列重復且高密度地暴露在顆粒的表面，誘發強烈的外源序列特異的體液和細胞免疫反應，從上世紀80年代中期就開始被運用于表位疫苗的研究。以下主要從影響HBc作為表位疫苗載體的因素，包括HBc長度、外源插入位點和表位序列的性質等來介紹HBc作為表位疫苗載體的應用。

乙肝核心蛋白，表位疫苗，疫苗載體，基因重組

Abstract:Hepatitis B virus core(HBc)proteins have been used as carrier for foreign epitopes since the 1980s.They could self-assemble into icosahedral particles.Foreign epitopes could be inserted into HBc protein in various protein regions, including the N- or C-terminal and the major immunodominant region(MIR).The factors relevant in the design of HBc particles for vaccine purpose are summarized in this review.

Keywords:hepatitis B virus core protein, epitope vaccine, vaccine carrier, gene recombination

重組的乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein，HBc)自上世紀80年代中期開始就被用于表位疫苗載體的研究，它能夠形成二十面體對稱病毒樣粒子(Virus-like particle，VLP)的結構，可以被用來展示外源序列。到目前為止，經其展示過的表位涉及病毒、細菌和原生動物蛋白表位(瘧原蟲、鉤端螺旋體)等[1]。HBc顆粒得以作為表位載體的實際運用主要在于它可以在自身表面重復且高密度地展示外源性序列，從而誘發強有力的體液或細胞免疫反應；Pumpens和 Grens[2]以及 Riedl等[3]曾報道，重組的HBc-VLP還能在免疫反應中發揮佐劑作用，并且可以經口腔途徑免疫[4]，這些都為現代的疫苗設計提供了新的思路。此外，作為病毒樣粒子，HBc還具有包裹核酸或其他小分子的能力，可以作為基因或藥物的運載工具[5]。另一方面，HBc作為表位載體的能力也受一些因素的限制。以下就有關這些方面的研究進展進行了簡述。

1 HBc的結構生物學特點

HBc由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBv)C基因的第2個起始密碼子起始翻譯而成，是乙肝核心抗原(Hepatitis B core antigen，HBcAg)的結構成分。單體的 HBc主要由 α-螺旋發夾結構組成(圖1)[6]，2個單體分子組裝二聚體結構，形成由 2個 α螺旋發夾構成的四螺旋束(圖2)，也就是冷凍電鏡下所觀察到的衣殼表面的刺突(Spike)[7]。刺突的頂端對應于HBc分子的78～82位氨基酸，是所形成的HBc-VLP表面主要的B細胞識別位點，也是主要的免疫顯性區域(Major immunodominant region，MIR)[2](圖1、2)。此外，2005 年，Roseman 等[8]報道，HBc單體的螺旋發夾結構有2種構象，每一個二聚體均由2個不同構象的單體構成。

圖1 HBV衣殼蛋白單體的結構模式圖Fig.1 Structure of the HBV capsid monomer.The structure data is obtained from Protein Data Bank(www.rcsb.org), the PDB ID is 1qgt.The MIR is shown in red, the α-helical hairpin is shown in purple, Cys is shown in jacinth.The α5 helical hairpin and C terminal arm which involved in capsid assembly are shown in yellow and green.

圖2 HBV衣殼蛋白二聚體的結構模式圖Fig.2 Structure of the HBV capsid dimer.The structure data is obtained from Protein Data Bank(www.rcsb.org), the PDB ID is 1qgt.The MIR is shown in red, the two HBc monomers which constitute a dimer are shown in dark blue and light blue.Cys is shown in jacinth, and Cys-61 in each molecular forms a disulfide bridge between the two monomers.

HBc-VLPs的結構中主要存在3種相互作用[6]，首先是疏水作用，主要用來維持單體的折疊和二聚體結構的穩定性；其次是共價鍵，主要是形成二聚體(圖2)的2個單體內，相應的Cys-48或Cys-61之間形成的分子間二硫鍵，但是這種作用對于二聚體或衣殼的形成影響不大，另外根據2個Cys-48之間二硫鍵形成的難易程度，也排除了天然HBc顆粒中有二硫鍵存在的可能；最后一種相互作用是 HBc分子α5螺旋的氨基酸和C端的臂之間的作用，這種作用與這兩個區域的氨基酸殘基組成及其側鏈結構有關，主要影響著顆粒的裝配與穩定性。

HBc所形成的衣殼在真核、原核、昆蟲及植物表達系統中均能得到正確的表達[1]。大腸桿菌所表達的HBc蛋白主要可以形成2種類型的顆粒[9]，分別是由180個單體形成的T=3型顆粒和由240個單體形成的T=4型顆粒。這兩種顆粒的表面分別有90或 120個刺突，并且有一些孔洞結構存在，這些孔洞可能是病毒基因組復制時核酸流通的路徑，也有可能是形成顆粒的HBc分子，其C端結構與顆粒外環境接觸的通道[6]。

2 HBc作為疫苗載體的應用

外源序列主要是通過兩種方式與 HBc建立關聯：基因重組和化學偶聯[10]。

2.1 基因重組

基因重組主要是將某T細胞表位和(或)B細胞表位的編碼序列直接插入 HBc編碼基因的特定位置，通過各種表達系統來得到插入該肽段的重組HBc-VLPs。在這個過程中可以通過對HBc的長度、外源序列的插入位點、外源序列的組合形式(例如：同種表位多拷貝串聯、異種表位串聯、目的表位與輔助表位串聯等)以及決定HBcAg自身免疫原性的若干氨基酸的缺失等重要參數進行修飾來確保外源序列高水平的B細胞和/或T細胞的免疫原性。

2.1.1 HBc的長度

HBc的長度影響著顆粒的裝配能力、顆粒的二態性、與核酸的結合能力和激發免疫的類型。

1)顆粒的裝配與二態性

天然的 HBcAg包含有 183或 185個氨基酸，Borisova等和Gallina等發現HBc蛋白C端精氨酸富集的區域150～183位氨基酸對顆粒的形成[11]和衣殼的大小與形態的維持[12]是非必需的，此外，Zlotnick等[9]通過使用由細菌表達的一系列不同長度的衣殼蛋白(1～149aa，1～147aa，1～142aa，1～140aa，1～138aa，3～144aa)在體外研究了衣殼的裝配過程。結果表明，大于或等于 140個氨基酸的結構才可以裝配成衣殼，而且會形成T=3或T=4型顆粒的混合物。這兩種顆粒可以通過蔗糖梯度分開，并且即使是在長期貯存的條件下也不會相互轉化。蔗糖梯度分級分離、分析超速離心和冷凍電鏡的結果證明T=3型顆粒的比例會隨著C端氨基酸缺失數目的增加而增加。此外，通過對T=4型(1～149aa)顆粒晶體結構的電子密度圖的分析發現，所表達的149位氨基酸的多肽中，C端的6個氨基酸(144～149aa)基本上沒有觀察到電子密度，這提示或許可以將形成顆粒所需要多肽的最小長度精確到 143[6]/144[13]個氨基酸。然而，也有文獻報道[2,14]，切除了 C端的HBc蛋白，雖然在表達量上有很大的提高，在形態上也與天然的顆粒差異不大，但是，去除了C端結構的HBc蛋白不夠穩定，因此有研究者在后期的操作中，為了使重組的結構能保持穩定，在C端添加一個半胱氨酸[15-16]。

2)核酸的結合位點及佐劑效應

HBc蛋白的 150～157aa和 157～177aa分別具有RNA和DNA結合活性[2]。一方面HBc可以作為潛在的B細胞激活劑來充分調動B細胞使之成為高效的促使抗原呈遞的細胞；另一方面這種C端核酸結合序列能非特異地結合少量真核或原核RNA，通過MyD88依賴性和非依賴性信號傳導途徑，激活NF-κB和MAPK，引發某些細胞因子的釋放及部分共刺激分子的上調，并最終激活特異性免疫系統，而且包裹在HBcAg顆粒中的RNA佐劑效應是游離RNA的1000倍[17]。本實驗室的研究也發現，炭疽桿菌保護性抗原(PA)與HBc的融合蛋白在免疫小鼠時，不加佐劑和使用氫氧化鋁佐劑組均能激發高效價的抗PA抗體，而且這兩組在激發抗PA抗體的能力上沒有顯著性差異。

3)HBcAg載體的長度影響著激發免疫的類型Th1/Th2

Zlotnick等[9]發現全長的HBc優先激發HBcAg Th1型反應，而突變體HBc-149或144顆粒優先激發Th2型反應。Th1型反應是與細胞毒和局部炎癥有關的免疫應答，涉及細胞免疫反應及遲發型超敏性炎癥的發生，在機體抗胞內病原體感染中發揮著重要的作用；Th2型反應主要涉及B細胞的增殖以及抗體的產生，與體液免疫相關。這提示可以針對病原體的不同類型(是否胞內病原體)采用不同的HBc蛋白長度。

2.1.2 外源表位的插入位點

對于外源插入位點的研究，主要集中在HBc的N端和 C端，以及刺突頂端的主要免疫顯性區域(MIR)，因為它們不參與關鍵的分子內和分子間的相互作用。

1)N端和C端

N端插入是最先使用的插入方式(表 1)。最初使用N端作為插入靶點開展的研究很多，但目前N端插入已經不是首選的插入方法。有文獻報道[2]，N端插入對外源序列的長度有一定的限制，大于50個氨基酸的長度可能會影響顆粒的組裝，過長的N端序列還可能會在空間上影響免疫效應細胞與正常的免疫顯性HBc刺突的接觸，從而影響免疫輔助作用的發揮[15]。目前進展最好的是基于HBc N端插入的流感候選疫苗。

C端插入也是較常用的插入方法(表1)。但是C端一般被包裹在衣殼的內部，所以融合在這個區域的序列有可能不能被暴露在衣殼表面。HBc顆粒的表面有孔洞存在，有些融合在C端的蛋白可以通過這些孔洞實現與免疫細胞表面受體的接觸，然而它們特異的B細胞免疫原性通常較低[1]。

表1 N端、C端和MIR插入能力簡表[1-2]Table 1 Capacity of the HBc carrier[1-2]

2)MIR區域

MIR區是目前研究得最多，也是應用最廣泛的插入區域(表1)。這主要是因為HBc分子78～82位氨基酸所對應的區域(MIR)，位于衣殼表面刺突的頂端，是主要的免疫顯性區域，插入到這個區域的外源序列不僅能被暴露在衣殼的表面，而且還能確保高水平的特異性的B細胞和T細胞的免疫原性[2]。例如，本實驗室發現[18]，將炭疽桿菌保護性抗原(PA)結構域 2 的 2β2?2β3loop(24aa)插入到 HBc的MIR的78～79位氨基酸之間，不僅可以形成電鏡下可見的顆粒狀結構，這些顆粒在小鼠和豚鼠模型上還可以誘導高效價的抗PA抗體和中和性抗體，并能保護部分豚鼠對抗炭疽毒力芽胞的攻擊。此外，雖然這個區域位于HBc分子的內部，但相對于N端和C端而言，它具有更大的插入容量，例如，綠色熒光蛋白的 238個氨基酸通過插入這個區域被天然地展示在了全長的HBc所形成的顆粒表面，嵌合體不僅顯示了熒光的能力，同樣也引發了針對天然 GFP的有力的體液反應[19]。Nassal等[20]將博氏疏螺旋體的整個外表面脂蛋白 A(OspA)的外功能區的 255個氨基酸和 OspC(OspC(a)，OspC(b))的二聚體的189個氨基酸長的突變體分別插入到 HBc的 MIR區，以研究HBc被開發成用于展示整鏈蛋白抗原的疫苗載體能力，雖然核心蛋白與兩個 OspC突變體的融合均可以有效地形成常規的VLPs，與OspA的融合只有部分能裝配成常規的VLPs，但是這些融合蛋白都可以激發有效的抗體反應，包括Ig同種型和針對保護性表位“LA-2”的特異性抗體，并主動和被動地保護小鼠對抗博氏疏螺旋體的攻擊。

另外，MIR區除了容量大以外，外源序列的插入，對該區域若干氨基酸進行缺失[1-2]或者加入一些輔助表位等，對于消除 HBc自身的抗原性/免疫原性，以及增強外源序列特異的免疫反應也是非常重要的。本實驗室發現，炭疽桿菌 PA結構域 2的2β2?2β3loop(24aa)在 HBc78～79 位氨基酸之間插入，或將79～81位氨基酸替換均可以顯著地降低抗HBc抗體的產生，插入組和替換組激發的抗HBc抗體效價比不插入組低10倍。Zhang等[21]在將口蹄疫病毒(FMDV)表位融合至 HBc顆粒的研究中分別構建了在 HBc MIR區缺失 3段不同長度氨基酸序列：75～78aa(3個氨基酸)，75～80aa(5個氨基酸)和75～82aa(7 個氨基酸)的展示載體(pHBc1，pHBc2，pHBc3)，并在這3個缺失部位分別插入了FMDV的多表位的不同組合，BT[VP1(141～160)?VP4(21～40)]和BTB[VP1(141～160)?VP49(21～40)?VP1(141～160)]，形成了6種不同的重組質粒。結果表明，pHBc3-BTB表達了可溶性的蛋白，并形成了電鏡下可見的完整的 VLP粒子。重組的 VLP可以被細胞吞噬并且在體內和體外均能被觀察到。更重要的是，經修飾的顆粒比其他5個重組蛋白和GST-BTB能更顯著地激發高效價的肽段特異性和病毒特異性抗體，提高IFN-γ和 IL-4的分泌水平，尤其是強化了淋巴細胞的增殖能力。

2.1.3 對于插入序列自身的要求

影響衣殼裝配的因素除了不同的插入位點會有插入長度的限制外，對于插入序列的組成也是有要求的。嵌合的HBcAg自我裝配的能力可能依賴于插入序列的氨基酸殘基的物理和化學性質。Karpenko等[22]發現在 MIR區進行插入的表位序列如果出現以下 3種情況會影響顆粒的裝配：表位高度的疏水性(High epitope hydrophobicity)、過長的表位序列(Large epitope volume)和高 β 鏈指數(High β-strand index)。這 3個參數的比值越高，HBcAg的融合蛋白形成顆粒的可能性就越小。有研究報道[22]高疏水性引起的裝配問題可以通過在一個宿主菌中共同表達天然的 HBcAg的基因和融合有外源序列的HBcAg的基因從而形成嵌合顆粒得到解決，而由高β鏈指數帶來的裝配問題可以通過去除HBcAg的β折疊結構或者在插入序列的C端與HBcAg載體相連的地方引入間隔序列(Spacer)來解決。值得注意的是，肽段在N端的插入沒有這種顯著的相關性，可能對于形成天然的蛋白結構而言，在N端和C端的插入沒有那么苛刻的結構上的要求。

此外，Billaud等[14]在對土撥鼠肝炎病毒核心抗原(Woodchuck hepatitis virus core antigen，WHcAg)的研究中發現，插入序列的荷電情況也影響嵌合顆粒裝配：帶正電荷的插入序列(高 pI)可能不利于二聚體的形成和/或顆粒的裝配等；甘氨酸的添加或置換或用天冬氨酸包圍插入的表位兩側，可以使原本不能裝配的嵌合顆粒變為可以裝配。只有酸性氨基酸可以改善攜帶有正電荷插入序列的，原本不能裝配的嵌合顆粒的裝配能力。其次，在同樣長度的載體中插入同樣的異源表位時，表位的插入位置只能影響顆粒的免疫原性而不能改變顆粒整體的免疫原性，位置效應最有可能反映的是表位在顆粒表面的暴露程度和/或其與MIR區域的位置關系。此外，將同一表位插入到不同C端長度的WHcAg的同一位置的結果表明，C端區域的結構可能通過影響顆粒的穩定性來影響顆粒的免疫原性。

2.2 化學偶聯

通過化學交聯劑將外源肽段直接結合到HBc表面是將外源序列暴露在HBc表面的另一種方式。鑒于經由基因融合所構建的蛋白在結構上可能存在位阻效應，插入 VLPs的外源肽段的大小限制著衣殼的裝配，或者是融合至N端或C端的序列不能被很好地暴露，影響免疫原性，或者某些嵌合的 VLPs在體內不穩定，Jegerlehner等[10]建立了直接將外源性肽交聯到HBcAg顆粒表面的疫苗形式，主要是通過基因工程的方法使肽段或蛋白含有一個自由的Cys，使HBcAg在MIR區含有一個Lys，讓分別含有 2個氨基酸的多肽或蛋白通過交聯劑交聯起來。這種方法可以消除衣殼裝配時的空間位阻，從而誘導強烈的B細胞反應。但是由于這種方法較重組技術而言：不可重復、生產困難、成本高、而且免疫原性相對較弱[14]，所以不是主流的設計方法。在基于 M2e的流感疫苗一項臨床前研究中，免疫原HBc/K77-M2e[15]就是通過這種方法構建的。

2.3 臨床實驗

目前較為成功的基于HBc所制備的重組疫苗主要是流感疫苗 ACAM-FLU-A?和瘧疾疫苗ICC-1132。

2.3.1 ACAM-FLU-ATM

ACAM-FLU-A?是由英國 Acambis[23]公司研制的針對流感病毒所有A型株的疫苗，它以HBc氨基端 163個氨基酸為載體[24-25]，來遞送流感病毒離子通道蛋白M2的胞外結構域M2e。2008年1月Acambis公司宣布已經完成了Ⅰ期臨床研究，在79名志愿者身上所進行的對疫苗的安全性和產生免疫反應能力的評價結果表明，ACAM-FLU-A?有很好的耐受性和免疫原性，所有的接種組中都能激發免疫反應，ACAM-FLU-A?+ QS-21組的免疫反應是最強烈的，這一組90%的受試對象都發生了血清型轉換。

2.3.2 ICC-1132

ICC-1132是由美國研制的針對瘧疾的疫苗，它主要是在HBc的MIR區的78位和79位氨基酸之間插入惡性瘧原蟲免疫顯性B細胞表位[(NANP)3]和一個HLA限制性CD4表位(NANPNVDPNANP)，并在HBc的149位氨基酸后融合一個通用的T細胞表位(T*)(326～345aa，NF54 isolate)[26]，ICC-1132于2008年完成了其在美國的Ⅰ期臨床的研究，在這之前，ICC-1132疫苗已經在一些歐洲國家完成了相應的臨床研究[27-29]。在51名18～45歲的健康的志愿者身上所開展的對ICC-1132+Al(OH)3的安全性，免疫原性和抗原性的臨床研究結果表明，這種候選的瘧疾疫苗ICC-1132在設計的所有劑量水平上都是安全的，而且有很好的耐受性，但是使用鋁佐劑時疫苗的免疫原性較弱，有待于與更有效的佐劑聯合以提高其免疫原性[26]。

3 其他

HBc VLPs近年來也被用于癌癥的研究，Zhang等[30]利用HBc VLPs展示了肝癌細胞(HCC)的單個或多個表位，4個HCC的表位MAGE-1(278～286aa)、MAGE-3(271～279aa)、AFP1(158～166aa)、AFP2(542～550aa)分別被融合或偶聯至截短的HBV核心基因的N端，雖然不是所有的重組質粒都能表達融合蛋白，但是那些能夠表達的蛋白，即使是包涵體的形式，也能形成完整的“成熟”的VLPs。由E.coli表達的截短的HBc(1～144aa)融合蛋白也可以自我裝配成VLPs，在形態學和物理學性質上都與野生型相似，而且這些VLPs即使是在6 mol/L尿素的條件下進行變性純化，所得到的產物經過復性后也依然保持著生物學活性。Song等[31]發現樹突細胞吞噬包裹有CpG的HBc VLPs可以增強CD8+誘導的胞毒T細胞反應和抗腫瘤效應，可以有效地促進基于 T細胞疫苗的發展。除了上述這些，截短的HBc還被用來構建基于細胞因子肽 IL-4的治療性疫苗[32]，這種IL-4疫苗抑制了小鼠呼吸道的炎癥反應，并為傳統的使用單克隆抗體或可溶性受體來阻斷過度產生的內源性細胞因子的方法提供了新的思路。此外，Huleatt等[33]發現，TLR5的配體鞭毛蛋白與流感M2e蛋白的 4拷貝串聯結構融合所得到的蛋白在不加佐劑和其他成分的情況下免疫小鼠，可以有效地激發M2e特異的抗體反應，并且這種抗體反應在數量和質量上都優于鋁佐劑參與的反應，在0.3 mg/只小鼠的劑量時可以保護小鼠對抗流感A型病毒的致死性攻毒。這提示，將特異性TLR的配體或其一部分整合至HBc可能會提高HBc作為免疫載體在沒有佐劑或其他輔助刺激免疫反應組分的存在下，激發抗原特異性反應的能力。

4 結語

對HBc作為表位疫苗載體的應用研究已經開展了近30年，研究者在各個層次都進行了探索，但是現有的以HBc為基礎的技術平臺還是有很多的理論和實踐的限制，其中最主要的就是“裝配(Assembly)”和“預存免疫(Preexisting immunity)”問題[22,34]。研究者普遍承認，在以HBc為疫苗平臺的研究中，只有不到50%的所選外源序列可以被成功地插入到 HBc，這種高失敗率被認為是由于外源序列的插入所導致的裝配顆粒失去穩定性所致[22]。對于預存免疫的問題，因為HBc是來自于人的病原體，大多數感染過HBV的個體，在體液中都會存在相當高效價的抗HBc抗體，這可能會降低疫苗的免疫原性[34]；基于 HBc的疫苗所激發的抗 HBc抗體可能會減弱以檢測抗 HBc抗體為主要指標的診斷HBV感染的診斷方法的準確性；最重要的是，在HBV慢性感染的個體中存在著 T細胞的免疫耐受[22]。然而令人興奮的是De Filette等[34]在小鼠實驗中證明，預存的 HBc特異性抗體既不會影響 M2e-HBc顆粒免疫后誘導M2e特異性抗體的產生，也不會影響所激發的免疫反應所帶來的保護效力，這提示，即使是在抗HBc陽性的個體中，基于HBc的融合顆粒可能也能夠誘導外源序列特異的保護性抗體，以及相應的保護作用，當然，相關的推測還有待臨床實驗的結果進行驗證。雖然需要解決的問題還很多，但已經有兩個基于 HBc的疫苗完成了Ⅰ期臨床的研究，這無疑給其他的研究者帶來很大鼓舞。

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Hepatitis B virus core protein as an epitope vaccine carrier:a review

Ying Yin, Junjie Xu, and Wei Chen
State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, China