分支桿菌噬菌體D29 Lysin B的表達、純化及酶學性質分析

侯麗麗，郝麗梅，祁建城，楊革

1 曲阜師范大學生命科學學院，曲阜 273165 2 軍事醫學科學院衛生裝備研究所 國家生物防護裝備工程技術研究中心，天津 300161

分支桿菌噬菌體D29 Lysin B的表達、純化及酶學性質分析

侯麗麗1,2，郝麗梅2，祁建城2，楊革1

1 曲阜師范大學生命科學學院，曲阜 273165 2 軍事醫學科學院衛生裝備研究所 國家生物防護裝備工程技術研究中心，天津 300161

克隆表達噬菌體D29 LysinB(LysB)并對其酶學性質進行研究。以噬菌體D29基因組為模板，用PCR方法擴增lys B基因，與表達載體pET22b連接，將重組質粒轉化至Escherichia coliBL21(DE3)中表達，鎳柱親和層析(Ni-NTA)純化可溶性表達產物，并對重組蛋白的活性進行分析檢測。結果表明：成功構建了pET22b-lysB表達載體，并從1 L的LB培養物中獲得了33.2 mg高純度重組蛋白(His-LysB)；His-LysB具有分解脂肪的能力，屬于脂肪酶；生物化學特性分析表明：丁酸對硝基苯(pNPB)為水解底物，His-LysB熱穩定性不佳，30℃以下比較穩定，隨著溫度的升高，穩定性逐漸降低；該蛋白具有較高的pH值適應性，pH 5.0～9.5范圍內穩定性較高；在23℃和pH 7.5時酶活力最高，其比酶活為1.3 U/mg；金屬離子Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制劑對酶活具有強烈的抑制作用。本研究為開發新的治療結核藥物提供了一個新的選擇。

噬菌體，分枝桿菌，裂解酶

Abstract:LysinB(LysB)in mycobacteriophage D29 was cloned and expressed and its enzymatic properties were analysed.ThelysBgene was amplified by PCR from mycobacteriophage D29 genomic DNA and inserted into pET22b vector.The constructed recombinant plasmid was transformed intoEscherichia coliBL21(DE3)to express fusion protein, which was purified by Ni-NTA column and enzymatic activity detected.The results showed that expression plasmid pET22b-lysBwas constructed successfully.Highly purified recombination protein(His-LysB)was obtained 33.2 mg from 1 L LB culture medium.A screening for His-LysB activity on esterase and lipase substrates confirmed the lipolytic activity.Withp-nitrophenyl butyrate as substrate,the thermal stability of the enzyme was poor when the temperature was above 30oC.The enzyme exhibited higher stability at pH 5.0–9.5.The optimum temperature and pH for the lipolytic activity of His-LysB were 23oC and 7.5 respectively.Under theoptimum conditions, the specific activity of His-LysB was 1.3 U/mg.Zn, Cu, Mg, Mnand phenylmethane sulfonyl fruoride severely inhibited the lipolytic activity of His-LysB.The result provides a new option for tuberculosis drug research and development.

Keywords:bacteriophage, mycobacteria, lysins

結核病是危害人類健康的重大傳染病，由于結核桿菌的多重耐藥菌株的出現，使得結核病的情況日益嚴峻，迫切需要開發新型抗結核藥物來縮短治療時間，殺死耐多藥與嚴重耐多藥結核桿菌。

大量的研究表明，噬菌體裂解酶在體內外都有快速有力的殺菌活性，且不會產生耐藥菌株。隨著大量分支桿菌噬菌體基因組測序工作完成，學者們開始致力于尋找它們的裂解酶基因。研究發現一些分支桿菌噬菌體的裂解酶基因簇除了編碼內溶素和穿孔素之外，還能編碼具有其他活性的蛋白，這主要是由分支桿菌獨特的細胞壁結構決定的。分支桿菌的細胞壁外膜含有豐富的分支菌酸，且該外膜與阿拉伯半乳糖-肽聚糖化合物共價連接[1-2]。分支菌酸是分支桿菌生長繁殖所必需的，也是抗菌藥物異煙肼等的主要攻擊目標。分支桿菌的外膜在獲取營養中起著重要的作用，同時它也是影響噬菌體裂解的一種潛在障礙[3-4]。因此，為實現對宿主菌的裂解，分支桿菌噬菌體除了需要編碼能水解肽聚糖層的內溶素之外，還需要借助另外一種酶來分解富含分支菌酸的外膜。

分支桿菌噬菌體Ms6的裂解酶基因簇已經被鑒定出來[5]，由5個基因組成，除了內溶素(LysA)和穿孔素(hol)基因外，位于lysA和hol之間的lysB(gp3)基因所編碼蛋白經鑒定[6]具有酯酶和脂肪酶的活性而并非內溶素的功能，是噬菌體能編碼具有分解脂肪活性蛋白的首次報道。噬菌體D29是一種烈性噬菌體，其基因組序列已被全部測定[7]。氨基酸序列分析表明 D29的 LysB(gp12)與 Ms6的LysB同源性為43%，Payne等[8]也已證實噬菌體D29的LysB不僅具有分解脂肪的活性，還是一種新型的分支菌酸?；⒗肴樘酋ッ福芰呀夥种Ь狨；⒗肴樘沁B接鍵并釋放出游離的分支菌酸，并指出LysB在裂解的后期通過破壞外膜與阿拉伯半乳糖-肽聚糖層之間的連接來實現宿主菌的完全裂解。由此可見，噬菌體D29的LysB對于輔助內溶素實現對分支桿菌的裂解以及提高宿主菌的裂解效率方面發揮著重要的作用。

本研究克隆出了噬菌體 D29的 LysB基因gene12，采用表達載體pET22b和表達宿主菌大腸桿菌 BL21(DE3)，高效表達并純化了重組蛋白His-LysB，活性鑒定表明His-LysB具有分解脂肪的活性。同時對His-LysB的酶學性質進行了研究，這不僅為今后研究分支桿菌噬菌體裂解酶基因簇之間及其與宿主菌之間的相互作用機制奠定了基礎，而且對于將裂解酶應用于結核病治療方面具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質粒

恥垢分支桿菌 ATCC 607和分支桿菌噬菌體D29由中國藥品生物制品檢定所王國治教授惠贈；E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α、pMD19-T Vecter購自TaKaRa生物公司；質粒pET22b由軍事醫學科學院生物工程研究所方宏清教授惠贈。

1.1.2 試劑

限制內切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶、DNA marker DL2000、1 kb DNA ladder marker、低分子量標準蛋白、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自TaKaRa生物公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自鼎國生物公司；引物合成與DNA測序由恒博和泰生物科技有限公司完成；培養基Middlebrook 7H9購自Difco公司；Ni-NTA為純泰Puribest產品；丁酸對硝基苯(pNPB)購自Sigma公司；其余試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體D29 lysB的克隆和重組表達載體的構建

提取 D29噬菌體的基因組[9]，以基因組為模板擴增噬菌體D29lysB基因。設計的上下游引物分別含有NdeI和NotI酶切位點：上游引物為：5′-AAGGAGATATACATATGAGCAAGCCCTGGCTGT-3′； 下 游 引 物 為 ： 5′-TGCTCGAGTGCGGCCGCG ATCTGTCGTAGGAACTCGACC-3′。PCR 條件：95℃5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環；72 ℃ 5 min 。

lysB基因片段回收、純化后與 pMD19-T 載體連接，連接產物轉化E.coliDH5α感受態細胞，重組克隆測序后正確，命名為pMD-lysB。用NdeI/NotI雙酶切pMD-lysB和pET22b質粒，切膠回收目的片段后連接，連接產物轉化E.coliDH5α感受態細胞，從陽性克隆中提取重組質粒經PCR和NdeI/NotI雙酶切檢驗正確后轉化到E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，得到表達菌株BL21(DE3)/pET22b-lysB。

1.2.2 重組LysB的表達及可溶性分析

挑取BL21(DE3)/pET22b-lysB單菌落，接入含有100 mg/L氨芐青霉素的LB培養基中，于37℃培養至OD600≈0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為 0.5 mmol/L，25℃誘導10 h。分別取誘導前后的培養菌液，進行SDS-PAGE電泳分析蛋白表達情況。

取1 mL誘導表達后的培養菌液，超聲破碎，分離可溶性蛋白和非可溶性蛋白，分別取樣進行SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的可溶性。

1.2.3 重組LysB的純化

離心收集IPTG誘導表達10 h的1 L培養菌液菌體(5000 r/min，4℃，10 min)，并重懸于破碎緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，pH 8.0)中超聲破碎，離心收集上清液并過Ni-NTA柱。用 5倍體積的含20 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗柱后，再分別用含有60、100、150、200、250、300 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液分步洗脫，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的純度，采用Bradford法測定蛋白濃度。純化后的重組蛋白經超濾離心管(截留分子量 10 kDa)濃縮并用儲存緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl，50%甘油)進行透析，分裝后于–20℃備用。

1.2.4 重組LysB活性分析[10-12]

取 37 μg的 His-LysB滴加在含有 1%(V/V)Tween 80或Tween 20以及1 mmol/L CaCl2的LB平板上，在23℃條件下孵育24 h，觀察有無白色沉淀產生。以蛋白質溶解液作為陰性對照。

將適當稀釋的酶液加入到200 μL含0.4 μmol/L丁酸對硝基苯(pNPB)的緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；0.2% Triton X-100)中，于室溫條件下反應30 min后測定405 nm處的吸光值，根據標準曲線計算出對硝基苯酚(pNP)的釋放量。以不加酶液的反應體系作為空白對照。在一定的溫度和pH條件下，每分鐘從底物溶液中分解產生1 μmoL pNP所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。

2 結果

2.1 表達載體的構建與鑒定

以噬菌體D29基因組DNA為模板，PCR擴增lysB基因片段，產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，呈現約 750 bp左右的特異性擴增條帶，大小與噬菌體D29的lysB(765 bp)相符。擴增產物與 pMD19-T載體連接得到pMD-lysB載體，測序結果與GenBank公布的核苷酸序列相差一個堿基，但不改變氨基酸殘基。用NdeI/NotI酶切pMD-lysB和pET22b載體，將目的片段回收后連接，得到 pET22b-lysB載體，轉化至E.coliDH5α感受態中，篩選的陽性克隆進行雙酶切鑒定，得到了兩條與預期大小(5371 bp和769 bp)相符的片段(圖1)，表明重組表達載體pET22b-lysB構建成功。

2.2 重組蛋白(His-LysB)的表達和純化

將 pET22b-lysB載體轉化進入E.coliBL21(DE3)感受態后，IPTG誘導表達，離心收集菌體，SDS-PAGE電泳結果表明在分子量約為29 kDa處有一明顯的蛋白條帶(圖2)，同預計的重組蛋白大小一致(29.5 kDa)，表明BL21(DE3)/pET22b-lysB表達成功，重組蛋白(His-LysB)約占全菌總蛋白的50%以上。蛋白的可溶性分析表明，重組蛋白(His-LysB)大部分是可溶性的，占全菌可溶性總蛋白含量的48.1%。

收集誘導后的菌體，超聲破碎，離心后取上清用Ni-NTA純化，SDS-PAGE薄層掃描分析顯示其純度大于85%。將純化的目的蛋白進行濃縮透析，測定蛋白濃度為3.7 g/L，目的蛋白的獲得量為每升LB培養物33.2 mg，分裝后?20℃儲存備用。

圖1 表達質粒pET22b-lysB的雙酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme analysis of pET22b-lysB.M1: 1 kb DNA ladder marker; M2: DNA marker DL2000; 1: pET22b digested withNdeI/NotI; 2: pET22b-lysBdigested withNdeI/NotI.

圖2 His6-LysB表達與純化的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of pET22b-lysBexpression and purification.M: low molecular weight markers; 1,2: uninduced and induced expression of BL21(DE3)carrying pET22b; 3,4:uninduced and induced expression of BL21(DE3)carrying pET22b-lysB, indication about 29 kDa fusion LysB protein; 5:purified His-LysB.

2.3 His-LysB活性鑒定

將純化的 His-LysB滴加在含有 Tween 20或Tween 80的LB平板上，均能觀察到白色沉淀圈(圖3)。Tween 20和Tween 80分別是含12個C的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯和含18個C的聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯，它們均能被分解脂肪的酶裂解成脂肪酸和乙醇。產生的脂肪酸與 Ca2+則形成不可溶的脂肪酸鹽，因此會在平板上形成白色沉淀。作為陰性對照的重組蛋白溶解液沒有產生白色沉淀。這一結果表明，His-LysB對脂肪酶作用的底物具有明顯的分解作用，其具有脂肪酶活性。

2.4 His-LysB酶學性質的研究

2.4.1 反應溫度對LysB活性的影響

將適當稀釋的酶液加入到含 0.4 μmol/L pNPB的TT緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；0.2%Triton X-100)中，在不同的溫度下反應30 min，測定LysB的最適反應溫度，結果見圖4。從圖4中可以看出該酶最適反應溫度為23℃左右。

2.4.2 反應pH值對LysB活性的影響

圖3 重組蛋白His-LysB的活性鑒定Fig.3 Effect of His-LysB activity on agar plates containing Tween 80 and CaCl2, Tween 20 and CaCl2.

2.4.3 LysB的熱穩定性

酶液置于不同溫度下溫浴30 min后，測定LysB的活性，以4℃存放的酶液作為對照，計算出相對酶活力，結果如圖6所示，該酶在30℃以下比較穩定，溫度高于30℃時，酶活力下降較快，37℃相對酶活力不到50%，當溫度達到55℃時，相對酶活幾乎為0，說明該酶的熱穩定性較差。

2.4.4 LysB的pH值穩定性

酶液經不同pH的緩沖液稀釋，室溫條件下處理1 h后測定LysB的酶活，結果如圖7所示，該酶在pH 5.0～9.5之間較穩定，相對酶活均大于80%。

圖5 pH對酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on the activity of His-LysB.

圖6 酶的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of His-LysB.

圖7 酶的pH穩定性Fig.7 pH stability of His-LysB.

2.4.5 不同金屬離子以及抑制劑對LysB活性的影響

將酶液加入到含一定濃度的不同金屬離子(5 mmol/L：Ca2+、K+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+)以及抑制劑(10 mmol/L： EDTA、PMSF)的緩沖液中于室溫條件下預處理 2 h，測定處理后的LysB活性，以未加金屬離子或抑制劑的LysB為對照，計算相對酶活力，結果見表1。除了Ca2+和EDTA對酶活沒有明顯影響外，其余金屬離子以及 PMSF對酶活均有不同程度的抑制，其中以 Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和 PMSF的抑制作用最為強烈。

表1 金屬離子和抑制劑對酶活力的影響Table 1 Effect of different metal ions and inhibitors on His-LysB activity

3 討論

本研究采用大腸桿菌表達系統對噬菌體D29的lysB基因進行了克隆表達，表達的重組蛋白約占全菌總蛋白的50%以上。蛋白的可溶性分析表明，重組蛋白大部分是可溶性的，占全菌可溶性總蛋白含量的 48.1%。經 Ni-NTA純化后的重組蛋白在分別含有Tween 80和Tween 20的LB平板上呈現出分解脂肪的活性。這說明該蛋白屬于脂肪酶。以 pNPB為底物，研究了重組蛋白的酶學性質，結果表明該重組蛋白在23℃和pH 7.5處活性最佳，比活性為1.3 U/mg。該酶的熱穩定性較差，在30℃以下比較穩定，溫度高于30℃時，酶活力下降較快；重組蛋白具有較廣的pH范圍，在pH 5.0～9.5之間較穩定。在所測試金屬離子和抑制劑中，除了 Ca2+和 EDTA抑制劑對酶活沒有明顯影響外，其余金屬離子以及PMSF酶活均有不同程度的抑制作用，其中以Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和 PMSF的抑制作用最為強烈，所以在該酶在處理和保存的過程中盡量避免與這些影響因子接觸。

噬菌體D29的LysB雖然并沒有表現出內溶素的功能，但作為一種脂肪酶在宿主菌的裂解過程中所發揮的作用是不容忽視的。因為分支桿菌與其他的革蘭氏陽性菌不同，它含有一個具有高濃度脂質(大于60%)的復雜的細胞壁。由于細胞壁中的分支菌酸-阿拉伯半乳糖-肽聚糖復合物的中心分布著一些特殊的脂質，從而使其形成了一種有效的表面滲透障[13]?；诜种U菌的這種細胞壁復雜性，分支桿菌噬菌體有必要編碼一種能分解脂肪的酶，以實現噬菌體對宿主菌的快速裂解。除此之外，由于分支桿菌具有富含分支菌酸的外膜，可能會使內溶素在體外難以發揮活性，從而影響了內溶素在治療結核上的應用。通過對 LysB的研究，設想通過內溶素LysA和LysB的聯合作用也許能實現對分支桿菌的體外裂解，具體是否可行還有待于進一步的實驗驗證。

本研究成功表達了具有脂肪酶活性的分支桿菌噬菌體D29的LysB蛋白并研究了LysB的酶學性質，為開發新的治療結核的藥物提供了一個新的選擇。

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住宅小區與醫院的間距每降低一千米，房價增長721元/m2。從圖3（f）可以看出：對房價影響較大的主要為西崗區、沙河口區和甘井子區。但在沙河口區和甘井子區等醫院分布較集中的區域出現了醫院對房價產生正、負中心依次顯現的現象，這表示醫院對房價的作用并不是單向的。因為一些地區由于醫療服務的便利性，使居民的就醫條件得到了顯著改善，從而房價上漲。但一些地區因為醫院分布太過密集，引發較多環境污染和交通擁堵問題，從而引起房價降低。

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Expression and purification of Lysin B in mycobacteriophage D29 and analysis of its enzymatic properties

Lili Hou1,2, Limei Hao2, Jiancheng Qi2, and Ge Yang1
1 College of Life Science, Qufu Normal University, Qufu 273165, China 2 National Bio-protection Engineering Center, Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300161, China

Received:November 26, 2009;Accepted:February 24, 2010

Supported by:Major National Science and Technology Special Projects during the 10th Five-year Plan for Prevention and Treatment of Major Infection Diseases: Study of New Methods for Tuberculosis Treatment(No.2008ZX10003-016).

Corresponding author:Jiancheng Qi.Tel: +86-22-84657486; E-mail: qijch@npec.org.cn Ge Yang.Tel: +86-537-4456909; E-mail: yangge100@126.com國家“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項“十一五”課題《結核病治療新方法的研究》(No.2008ZX10003-016)資助。