靈芝免疫調節蛋白LZ-8的制備和晶體分析

安敏，高福，齊建勛，李鋒，劉杏忠

中國科學院微生物研究所 真菌地衣系統學重點實驗室，北京 100101

醫學與免疫生物技術

靈芝免疫調節蛋白LZ-8的制備和晶體分析

安敏，高福，齊建勛，李鋒，劉杏忠

中國科學院微生物研究所 真菌地衣系統學重點實驗室，北京 100101

LZ-8蛋白是從靈芝菌絲中分離到的真菌免疫調節蛋白，具有多種免疫調節功能，然而這一蛋白的作用機制尚不清楚。通過蛋白質晶體結構的解析，能夠得到蛋白質空間結構特點，從而闡述蛋白質功能的機制。旨在得到LZ-8蛋白的晶體，并獲得空間結構數據。以pET21a為表達載體，獲得誘導表達的rLZ-8，通過親和層析、分子篩凝膠層析和陰離子交換層析純化，蛋白純度在98%以上，采用懸滴氣相擴散法得到蛋白晶體，并獲得3.2?數據，為進一步對真菌免疫調節蛋白功能和結構的研究奠定了基礎。

LZ-8，真菌免疫調節蛋白，晶體衍射

Abstract:LZ-8 protein, isolated from a well known Chinese traditional medicinal fungusGanoderma lucidum, is the first member of fungal immunomodulatory protein, members of which have been isolated from a variety of medicinal and edible mushrooms in the last two decades. The protein plays a multifunctional and important role in modulating immune system. In this report, in order to get LZ-8 protein crystals, the LZ-8 gene was expressed and purified by affinity chromatography, gel filtration chromatography and anion exchange chromatography subsequently. The protein was then crystallized using the hanging-drop vapour-diffusion method. The LZ-8 crystals were obtained and the phase information was calculated by X-ray diffraction. The resolution of LZ-8 crystals is 3.2?. This study will provide an insight into the structure of fungal immunomodulatory proteins.

Keywords:LZ-8, fungal immunomodulatory protein, crystal diffraction

擔子菌綱多孔菌目靈芝屬的靈芝Ganoderma lucidum是傳統中醫學中被廣泛應用的一種中藥材，在我國的眾多古典醫學資料中都對它有詳盡的描述。作為一種重要的中藥材，靈芝在抗腫瘤、保肝解毒、治療心血管系統疾病、抗神經衰弱作用、抗菌消毒以及抗衰老等多種臨床應用方面具有良好的效果[1]。經過研究分析，靈芝中的主要有效化學成分包括多糖類化合物、甾、萜類化合物、生物堿、氨基酸和蛋白質等多種物質[1]。其中在靈芝中發現的真菌免疫調節蛋白LZ-8 (LingZhi-8)[2]成為了近幾年來研究的熱點。

1989年日本科學家 Kino首次從靈芝菌絲體中提取到了一個由111個氨基酸構成的12 kDa大小的小分子蛋白——LZ-8蛋白。之后，科學家又從藥、食用真菌松杉靈芝G. tsugae[3]、金針菇Flammulina velutipers[4]、草菇Volvariella volvacea[5]、牛樟芝Antrodia camphorata[6]、紫芝G. sinensis[7]等真菌菌絲或子實體中提取到了性質、功能與LZ-8非常相似的蛋白，科學家將這一類蛋白歸為同一個蛋白家族，命名為真菌免疫調節蛋白 (Fungal immunomodulatory protein，FIP) 家族。以LZ-8為代表的這一蛋白家族具有很多類似的免疫調節功能。在體外，LZ-8可以刺激DBA/2小鼠[8]、非肥胖性I型糖尿病小鼠脾淋巴細胞[9]增殖，促進單核細胞起源的樹突狀細胞(DC) 的活化和成熟[10]，而且用酵母異源表達的LZ-8蛋白可以促進巨噬細胞的吞噬作用[11]。這種增殖功能也有類似于凝集素的劑量依賴特點，但不會因為多糖或者單糖的加入而受到抑制[2]。在體內，LZ-8蛋白可以防止非肥胖性I型糖尿病小鼠由自身免疫系統缺陷造成的胰腺炎的發生[9]，同時也能夠抑制阿爾圖斯 (Arthus) 過敏反應[2]，可能原因是LZ-8蛋白能夠抑制由特殊抗原引起的抗體產生[12]，因此在移植外源胰臟的小鼠體內腹腔注射 LZ-8蛋白可以抑制胰臟的排異反應，延長小鼠壽命[13]。此外，LZ-8蛋白可以促進黏附分子ICAM-1的表達[14]，從而促進了免疫分子與其他細胞分子間的相互黏合，以達到發揮免疫調節的功能。同時，與LZ-8蛋白氨基酸序列完全相同的松杉靈芝免疫調節蛋白(FIP-gts) 可以促進人類外周血淋巴細胞分泌白介素2 (IL-2)、白介素 4 (IL-4)、腫瘤壞死因子 α (TNF-α) 和干擾素γ (INF-γ) 等細胞因子[3]，調節人類體液免疫。

雖然以 LZ-8蛋白為代表的真菌免疫調節蛋白家族的功能已經得到了多方面的研究，然而這類蛋白的作用機制仍沒有得到很好的闡述。由于蛋白質的高級結構決定了蛋白質所具有的功能，因此對蛋白質三維結構的研究能夠從本質上揭示蛋白的作用機制。2003年，該家族的第一個晶體結構——金針菇免疫調節蛋白 (FIP-fve) 的晶體結構被解析，對這個家族蛋白的結構特點有了初步了解，然而并不能完全解釋該蛋白家族功能機制[15-17]。本研究通過原核系統大量表達重組LZ-8蛋白，采用懸滴氣相擴散法得到蛋白結晶，利用 X-光晶體衍射技術獲得LZ-8蛋白在分辨率為3.2 ?空間結構的信息。

1 材料與方法

1.1 菌種與質粒

靈芝G. lucidum菌種444為中國科學院微生物研究所文華安教授提供；克隆宿主菌E. coliDH5α，表達宿主菌E. coliBL21(DE3)，表達質粒 pET21a均由本實驗室保存。

1.2 化學試劑和材料

蛋白胨、酵母抽提物購自Oxoid公司。各種工具酶、混合dNTPs、DNA電泳分子量標準、pMD18-T simple載體購自大連TaKaRa公司。質粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物技術公司。DNA凝膠回收試劑盒購自Promega公司。Ni-NTA Agarose購自GE公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo Fisher公司。分子篩柱Superdex 75 10/300 GL和陰離子交換柱Resource Q均為Amersham Bioscience公司生產。晶體初篩試劑盒購自Hampton Research公司。引物合成和測序反應由上海英駿生物技術有限公司完成。其他各種化學試劑為進口或國產分析純試劑。

1.3 培養基

LB培養基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，Amp終濃度100 μg/mL。PDA綜合培養基：葡萄糖20 g/L；蛋白胨3.0 g/L；KH2PO43.0 g/L；MgSO4·7H2O 1.5 g/L；維生素 B120 mg/L；馬鈴薯浸取液 (去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1.0 L煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1.0 L)；pH 6.0。

1.4 重組質粒pET21a-LZ-8的構建

將菌種444在PDA綜合培養基培養2周后，收集菌絲球。由于LZ-8基因中不含內含子[2]，因此利用酚-氯仿法提取菌種的基因組DNA作為PCR反應的模板。PCR反應條件如下：95 ℃ 3 min ；95℃30s，55℃30s，72℃45 s，循環 30次；72 ℃ 10 min 。PCR 引物如下：F：5′-GGAATTCCATATGATGTCCG ACACTGCCTTGAT-3′，R：5′-GGAATTCTTAATGAT GATGATGATGATGAGTTCCACTGGGCG-3′。引物R含有表達6個His的序列，F和R分別含有NdeI和EcoRI的限制性酶切位點 (下劃線部分為酶切位點)，將擴增后的目的片段經過酶切、純化連接到表達載體 pET21a上，構建重組質粒 pET21a-LZ-8。重組質粒通過酶切鑒定和 DNA測序來確保其準確性。

1.5 rLZ-8蛋白的表達純化

將重組質粒轉化入BL21(DE3) 感受態細胞中，在37℃條件下用1 mmol/L IPTG誘導4 h，得到可溶性表達的目的蛋白。大量搖菌、超聲破碎后，將離心得到的上清與Ni-NTA Agarose結合2 h。之后用200 mmol/L的咪唑溶液洗脫目的蛋白。濃縮后進一步通過凝膠層析法和陰離子交換層析得到純化的帶有His-tag的rLZ-8蛋白。

1.6 rLZ-8蛋白的晶體生長

利用結晶試劑盒，采用懸滴法篩選 rLZ-8蛋白晶體培養條件。通過初篩條件，改變沉淀劑濃度、鹽濃度、pH值以及蛋白濃度進行優化。最終在沉淀劑為 0.6 mol/L酒石酸鉀鈉 (Potassium sodium tartrate)，緩沖液0.1 mol/L 1,3-二［三 (羥甲基) 甲氨基］丙烷 (Bis-tris propane)，pH 7.5的條件下獲得可供衍射的晶體，此時蛋白濃度為5 mg/mL。

1.7 解析結構方法

利用分子置換法解析結構。

2 結果

2.1 重組質粒pET21a-LZ-8的構建和表達

利用靈芝的基因組 DNA為模板，PCR擴增得到LZ-8基因片段，純化回收后將其連接在pMD18-T simple載體上，經菌落PCR和雙酶切鑒定后，挑取陽性克隆，提取質粒，并利用NdeI和EcoRI進行雙酶切。回收純化雙酶切后獲得的片段，連接到pET21a載體中。將連接產物轉化入大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，提質粒進行雙酶切鑒定，最后進行測序驗證，最終獲得重組質粒命名為 pET21a-LZ-8(圖 1)。

圖1 LZ-8基因PCR擴增及重組質粒雙酶切鑒定Fig.1 PCR amplification of LZ-8 gene and double enzyme digestion of the recombinant plasmid. (A) PCR amplification of LZ-8 gene. M: DNA marker; 1: PCR product of LZ-8. (B)Double enzyme digestion of the recombinant plasmid. M: DNA marker; 2: double enzyme digestion of pET21a-LZ-8 byNdeI andEcoR I.

2.2 rLZ-8蛋白的表達純化

將測序鑒定正確的重組質粒轉入表達宿主菌BL21(DE3) 中，挑取單克隆后液體培養，在OD500達到0.4～0.6之間時加入1 mmol/L IPTG進行誘導表達。SDS-PAGE分析表明，在接近14 kDa處有一條明顯的目的蛋白帶。超聲裂解細菌后離心，目的蛋白以可溶性蛋白形式存在，表達量很高 (圖2)。

圖2 SDS-PAGE分析rLZ-8表達產物Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression of rLZ-8. M:protein marker; 1?3: rLZ-8 expression after induced by IPTG;4: negative control; 5: the supernatant after sonicating the cells expressing rLZ-8.

將超聲裂解細菌的產物在4℃下16 000 r/min高速離心10 min，取上清與Ni-NTA Agarose結合4 h，用50 mmol/L咪唑溶液清洗結合到層析柱上的雜蛋白直到蛋白檢測液不再變藍，之后用200 mmol/L的咪唑溶液將目的蛋白洗脫。濃縮洗脫下來的目的蛋白至體積約為5 mL，加樣至Superdex 75 10/300 GL進行凝膠層析。主峰中的樣品經SDS-PAGE驗證是LZ-8重組蛋白。蛋白出峰位置的分子量約為28 kDa，是蛋白形成二聚體后的分子量大小，即帶有His-tag的rLZ-8蛋白與天然狀態的 LZ-8蛋白一樣是以二聚體形式存在 (圖3)。將主峰中的蛋白收集，濃縮到5 mL左右，再通過陰離子交換層析進一步純化。通過SDS-PAGE的驗證，陰離子交換層析主峰中的蛋白為目的蛋白 (圖4)。

圖3 rLZ-8蛋白分子篩層析圖Fig.3 Superdex 75 gel filtration profile of the rLZ-8 protein.The main peak is rLZ-8 protein.

圖4 rLZ-8蛋白陰離子交換層析圖Fig.4 Further purification of the rLZ-8 protein by anion exchange. M: protein marker. The main peak is rLZ-8 protein.

2.3 rLZ-8蛋白晶體的生長

將陰離子交換層析純化后主峰中的蛋白濃縮至 5 mg/mL的濃度，利用懸滴法以及晶體試劑盒對蛋白進行晶體形成條件初篩。在初篩約24 h后，觀察發現在Salt以及Crystal試劑盒的22個條件有晶體長出，利用 X-ray衍射鑒定是蛋白質晶體。初篩時的蛋白晶體個體較小，形狀不規則，很多小晶體混雜生長在一起，衍射率較低 (圖5A)。之后，對初篩時晶體生長較大、較結實的條件進行鹽離子濃度和pH值的梯度優化，在0.6 mol/L酒石酸鉀鈉沉淀劑、0.1 mol/L Bis-tris propane緩沖液 (pH 7.5)的條件下得到了分辨率為3.2 ?的晶體。經過優化的晶體個體較大，形狀為較規則的六邊形，晶體為單個晶體，而且比較厚實，分辨率較高 (圖5B)。

圖5 初篩 (A) 及優化 (B) 條件的rLZ-8晶體形態Fig.5 Initial (A) and optimized (B) crystals of the rLZ-8 protein.

2.4 rLZ-8晶體衍射數據的收集

利用 X-ray衍射設備收集優化后的蛋白質晶體中各原子的衍射數據 (圖6)。優化數據至3.2 ?。晶體屬于P6422空間群，晶胞參數分別為：a=b=76.473 ?，c=177.476 ?，α=β=90°，γ=120°。通過進一步的晶體優化可以解析蛋白結構 (表 1)。目前正在應用分子置換的方法進行結構解析。

表1 rLZ-8蛋白晶體的衍射數據Table 1 X-ray diffraction data of the rLZ-8 protein

圖6 rLZ-8蛋白晶體X射線衍射圖Fig.6 Typical diffraction pattern of the rLZ-8 protein.

3 討論

本文通過原核表達，獲得帶有His-tag的靈芝免疫調節蛋白LZ-8，通過分子篩層析顯示為二聚體蛋白，與天然LZ-8蛋白相同，均為二聚體蛋白。天然的 LZ-8蛋白不含有 Met、Cys、His[2,17]，所以它們是由非共價鍵作用形成二聚體的。由于重組表達的LZ-8蛋白中也不含Cys、Met，因此重組蛋白也是由非共價鍵作用而生成的二聚體蛋白。這一結構與已經解析結構的FIP-fve一致。LZ-8與FIP-fve在氨基酸序列上相似性很高，推測LZ-8與FIP-fve應該有很相似的晶體結構。通過這一結構的進一步解析，可以解釋真菌免疫調節蛋白所具有的免疫調節功能的本質原因。

本研究成功獲得了LZ-8的蛋白晶體，并且獲得了3.2 ?的數據，通過進一步蛋白晶體優化，提高晶體各原子相位分辨率，將對晶體結構的解析提供良好的數據，為解釋以LZ-8蛋白為代表的真菌免疫調節蛋白的功能以及對該家族蛋白的應用提供了結構基礎。

本研究雖然對LZ-8的晶體進行過多次優化，但是都沒有提高分辨率。可能原因是LZ-8晶體生長速度太快，使原子沒有時間形成有序排列，從而造成分辨率不高。進一步晶體優化過程中，如果能夠減慢晶體的生長速度，將有助于原子形成有序排列，從而使分辨率提高。

對重組LZ-8結構的解析確定，將有利于對LZ-8蛋白開展功能機制的進一步研究。同時，這種結構研究方法可以應用于中草藥的其他蛋白的結構及功能研究，為我國的中醫研究應用提供更多支持。

REFERENCES

[1] Lin ZB.Lingzhi: From Mystery to Science. Beijing:Peking University Medical Press, 2009.

[2] Kino K, Yamashita A, Yamaoka K,et al. Isolation and characterization of a new immunomodulatory protein,Ling Zhi-8 (LZ-8), fromGanoderma lucidium.J Biol Chem, 1989, 264(1): 472?478.

[3] Lin WH, Hung CH, Hsu CI,et al. Dimerization of the N-terminal amphipathic alpha-helix domain of the fungal immunomodulatory protein fromGanoderma tsugae(FIP-gts) defined by a yeast two-hybrid system and site-directed mutagenesis.J Biol Chem, 1997, 272(32):20044?20048.

[4] Ko JL, Hsu CI, Lin RH,et al. A new fungal immunomodulatory protein, FIP-fve isolated from the edible mushroom,Flammulina velutipesand its complete amino acid sequence.Eur J Biochem, 1995, 228(2):244?249.

[5] Hsu HC, Hsu CI, Lin RH,et al. Fip-vvo, a new fungal immunomodulatory protein isolated fromVolvariella volvacea.Biochem J, 1997, 323: 557?565.

[6] Sheu F, Chien PJ, Hsieh KY,et al. Purification, cloning,and functional characterization of a novel immunomodulatory protein fromAntrodia camphorata(Bitter Mushroom) that exhibits TLR2-dependent NF-kappaB activation and M1 polarization within murine macrophages.J Agric Food Chem, 2009, 57(10): 4130?4141

[7] Zhou X, Xie M, Hong F,et al. Genomic cloning and characterization of a FIP-gsi gene encoding a fungal immunomodulatory protein fromGanoderma sinense.(Aphyllophoromycetideae).Int J Med Mushrooms,2009,11(1): 77?86.

[8] Kino K, Yamashita A, Yamaoka K,et al. Isolation and characterization of a new immunomodulatory protein,Ling Zhi-8 (LZ-8), fromGanoderma lucidium.J Biol Chem, 1989, 264(1): 472?478.

[9] Kino K, Mizumoto K, Sone T,et al. An immunomodulating protein, Ling Zhi-8 (LZ-8) prevents insulitis in non-obese diabetic mice.Diabetologia, 1990,33(12): 713?718.

[10] Lin YL, Liang YC, Tseng YS,et al. An immunomodulatoryprotein, Ling Zhi-8, induced activation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells by the NF-kappaB and MAPK pathways.J Leukoc Biol, 2009,86(4): 877?889.

[11] Liang CY, Zhang SQ, Liu ZY,et al.Ganoderma lucidumimmunomodulatory protein (LZ-8) expressed inPichia pastorisand the identification of immunocompetence.Chin J Biotech, 2009, 25(3): 441?447.

梁朝陽, 張淑芹, 劉志屹, 等. 靈芝免疫調節蛋白(LZ-8) 在畢赤酵母中的表達及其免疫活性鑒定. 生物工程學報, 2009, 25(3): 441?447.

[12] Kino K, Sone T, Watanabe J,et al. Immunomodulator,LZ-8, prevents antibody production in mice.Int J Immunopharmacol,1991, 13(8): 1109?1115.

[13] Van der Hem LG, Van der Vliet,et al. LingZhi-8: studies of a new immonomodulating agent.Transplantation, 1995,60(5): 438?443.

[14] Haak-Frendscho M, Kino K, Sone T,et al. Ling Zhi-8: a novel T cell mitogen induces cytokine production and upregulation of ICAM-1 expression.Cell Immunol, 1993,150(1): 101?113.

[15] Seow SV, Kuo IC, Paaventhan P,et al. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies on the fungal immunomodulatory protein Fve from the golden needle mushroom (Flammulina velutipes).Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2003, 59: 1487?1489.

[16] Paaventhan P, Joseph JS, Seow SV,et al. A 1.7? structure of Fve, a member of the new fungal immunomodulatory protein family.J Mol Biol, 2003, 332(2): 461?470.

[17] Tanaka S, Ko K, Kino K,et al. Complete amino acid sequence of an immunomodulatory protein, Ling Zhi-8(LZ-8). An immunomodulator from a fungus,Ganoderma lucidium, having similarity to immunoglobulin variable regions.J Biol Chem, 1989, 264(28): 16372?16377.

Expression and crystallographic studies of a fungal immunomodulatory protein LZ-8 from a medicinal fungusGanoderma lucidum

Min An, George Fu Gao, Jianxun Qi, Feng Li, and Xingzhong Liu

Key Laboratory of Systematic Mycology and Lichenology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

Received:April 21, 2010;Accepted:May 10, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA021506).

Corresponding author:Xingzhong Liu. Tel: +86-10-64807505; E-mail: liuxz@im.ac.cn

國家高技術研究發展計劃 (863計劃) (No. 2007AA021506) 資助。