hNoc4L基因重組慢病毒表達載體的構建與鑒定

王婷婷，王淑娟，嚴景華

1 中國科學院微生物研究所 中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101

2 中國科學院研究生院，北京 100049

3 中國動物衛生與流行病學中心，青島 266032

醫學與免疫生物技術

hNoc4L基因重組慢病毒表達載體的構建與鑒定

王婷婷1,2，王淑娟3，嚴景華1

1 中國科學院微生物研究所 中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101

2 中國科學院研究生院，北京 100049

3 中國動物衛生與流行病學中心，青島 266032

核糖體前體的形成和核運輸需要多種核仁復合物的參與，hNoc4L是釀酒酵母S. cerevisiae的核仁復合物相關蛋白4的同源蛋白，并含有保守的Noc結構域，但其功能未知。為了構建hNoc4L基因過表達的慢病毒載體，本實驗通過將EF1α啟動子替換原shRNA慢病毒載體pll3.7的U6啟動子，成功構建了慢病毒表達載體pll3.7-EF1，并進一步得到了hNoc4L基因過表達的慢病毒載體。利用慢病毒包裝系統對不同物種的細胞進行感染，以此檢測該重組慢病毒載體的包裝效率，并通過構建的hNoc4L過表達的RAW264.7穩定細胞系檢測了該載體的免疫原性和穩定轉染能力。結果表明成功構建了高效、長期穩定表達和免疫原性低的hNoc4L特異性表達的慢病毒載體，為進一步研究hNoc4L蛋白在哺乳動物核糖體生物發生中的調控作用奠定了基礎。

hNoc4L基因，慢病毒表達載體，核糖體生物發生

Abstract:Formation and nuclear export of pre-ribosomes requires many nucleolar complexes. hNoc4L which contains a conserved Noc doman is a homolog of nucleolar complex associated 4 (S. cerevisiae), but its function is completely unclear. Here, we successfully got the recombinant lentiviral vector pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag by replacing the U6 promoter in pll3.7 with EF1α promoter, and then insertedhNoc4Lto down-stream of the EF1α prompter. We determined the transduction efficiency in different mammalian cell lines based on lentiviral packaging system. Subsequently, we analyzed the immunogenicity of the recombinant lentivirus and stable expression ofhNoc4Lin RAW264.7 cells.The results showed that the recombinant lentivirus characterized a high transduction efficiency, long-term expression and low immunogenicity. Therefore, we pave the way for further identification of the biological activity of hNoc4L protein during ribosome biogenesis in mammalian.

Keywords:hNoc4Lgene, lentiviral expression system, ribosome biosynthesis

從細菌到人類所有生命的細胞中都存在著成千上萬的核糖體，核糖體是蛋白質的翻譯場所，負責細胞內蛋白質的合成，對細胞的生長、組織的分化和發育十分重要。細胞的大部分物質與能量都用于核糖體的合成，正在生長的細胞中，與核糖體生物發生相關的基因的轉錄約占整個細胞轉錄體系的60%以上[1]。由此可知，對核糖體生物合成的調控是細胞調控的關鍵步驟。目前，對于真核生物核糖體生物發生的基本過程已有初步的認識，但其中詳細的機制尚不清楚，仍是一個研究熱點。

在真核生物中，核糖體的生物發生是一個高度復雜和協同進行的過程，發生在不同的亞細胞器中，需要3種RNA聚合酶共同協調轉錄上百個基因，其中包括核仁區的 RNA聚合酶Ⅰ負責轉錄的pre-rRNA，細胞質中的RNA聚合酶Ⅱ負責轉錄的核糖體蛋白基因以及細胞核內的 RNA聚合酶Ⅲ負責轉錄的5S rRNA[2]。對酵母的研究發現，核糖體的生物發生主要在核仁里，后期的成熟過程是在細胞核和細胞質中進行的，主要為pre-rRNA經過多種剪切、修飾等步驟加工為成熟的 18S、5.8S和28S rRNA，與進入核仁的5S rRNA以及來自細胞質的多種相關蛋白質相結合，組裝成核糖體的大小亞基的前體，再分別轉運至細胞質中進一步成熟，組裝成有功能的核糖體[3-4]。

在核糖體的大小亞基的組裝、運輸和成熟的過程中，反式調控因子發揮著十分重要的作用[5-7]，Noc(Nucleolar complex) 類蛋白復合物就是新發現的影響核糖體成熟和核運輸的重要的反式調控因子。Noc類蛋白是一類核仁復合物相關蛋白，在以酵母為模式生物的研究中發現，Noc1、Noc3和Noc4均有一個由45個氨基酸組成的保守的Noc結構域[8-9]，其中Noc1-Noc2和Noc3-Noc2異源二聚體在60S核糖體前體的成熟和出核運輸中發揮重要作用，而Noc4-Nop14 (Nucleolar protein 14) 異源二聚體在40S核糖體前體的成熟和核運輸中發揮重要作用[9]。hNoc4L(Human nucleolar complex associated 4 homolog)，人核孔復合物蛋白4同源體，NCBI編號為Homo sapiens (mRNA，MGC3162)，其編碼產物為516個氨基酸組成的多次跨膜蛋白hNoc4L，與酵母 Noc4有相同的保守的 Noc結構域，但其功能尚未有研究報道。因此本文構建了hNoc4L基因特異性表達的慢病毒載體，該重組病毒能感染小鼠成纖維細胞 NIH3T3、猴腎細胞 Marc145、小鼠巨噬細胞RAW264.7和狗腎細胞 MDCK，并得到了穩定表達hNoc4L基因的 RAW264.7細胞株，檢測了重組病毒的感染效率及免疫原性，為后續研究 hNoc4L蛋白的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株

人胚腎細胞293T、猴腎細胞Marc145、狗腎細胞MDCK、小鼠成纖維細胞NIH3T3和小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞，均為本實驗室保存。

1.1.2菌種與載體

大腸桿菌 DH5α為本實驗室保存，質粒pEF-BOS、pcDNA3.0-hNoc4L-Flag為本實驗室保存，shRNA慢病毒載體 pll3.7、包裝質粒 pLP1、pLP2和pLP/VSVG由中國科學院微生物研究所高斌研究員惠贈。pMD-18T載體購自TaKaRa公司。

1.1.3工具酶及其他

DNA聚合酶、各種限制性內切酶均購自TaKaRa公司；轉染試劑PEI購自ROCHE公司，Polybrene購自INTROVIGEN公司；去內毒素超純質粒大提試劑盒購自博大泰克生物技術公司，DNA凝膠回收純化試劑盒購自OMEG公司，完全培養基為含10%胎牛血清 (FBS) 的DMEM培養基，為GIBCO產品；小鼠IL-6和TNF-α ELISA預包被試劑盒購自北京達科為生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1重組質粒的構建[10]

真核表達載體 pll3.7-EF1的構建：首先，PCR獲得EF1α啟動子全序列，即以pEF-BOS為模板，以 F1、R1為引物擴增 EF1α啟動子全序列。PCR反應參數：94℃預變性5 min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2 min，30個循環；72℃延伸10 min，16℃保溫5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離產物，應用OMEG公司的DNA凝膠回收試劑盒回收并純化EF1α啟動子片段，目的片段大小約1 200 bp。用T4 DNA連接酶將目的片段連接到pMD-18T載體上并轉入DH5α感受態細胞，挑取克隆進行菌液PCR和雙酶切鑒定正確后，進行測序。用XbaI和XhoI對質粒pll3.7雙酶切以切除U6啟動子，凝膠電泳回收純化pll3.7的片段。酶切后pll3.7的大小約為 7 100 bp。同樣的方法對質粒 pMD-18T-EF1α進行雙酶切，回收EF1α片段。將兩者用T4 DNA連接酶連接，對所得克隆進行菌液PCR和雙酶切鑒定，獲得重組質粒pll3.7-EF1，構建結構圖見圖 1。所用引物如下(5′?3′)：F1: GCTCTAGAC GTGAGGCTCCGGTGCCCGTC；R1: CCGCTCGAG TCACGACACCTGAAATGGAA。

重組表達載體pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag的構建：用XhoI和NotI對質粒 pll3.7-EF1和 pcDNA3.0-hNoc4L-Flag進行雙酶切，DNA凝膠電泳回收純化pll3.7-EF1和hNoc4-Flag-His的片段。將兩者用T4 DNA連接酶連接轉入DH5α感受態細胞，對所得克隆進行菌液 PCR和雙酶切鑒定，獲得重組質粒pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag。

圖1 重組質粒載體的構建示意圖Fig.1 Construction of recombinant plasmids. A: EF-1α; B: pll3.7-U6; C: hNoc4L-Flag-his.

1.2.2重組慢病毒的包裝

重組表達型慢病毒載體pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag、包裝質粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG分別用試劑盒進行超純去內毒素大量提取，利用 PEI法共轉染HEK 293T細胞。轉染主要步驟 (以10 cm培養皿為例)：將 18 μg質粒 (載體和包裝質粒各 4.5 μg) 和144 μg PEI分別溶于生理鹽水中，使其終體積均為200 μL，混勻；靜置5 min后，將兩者混合，再靜置20 min，將質粒-PEI混合物逐滴加入到細胞培養皿中，4～6 h后更換新鮮的完全培養基 (DMEM+ 10%FBS，下同)。轉染 24 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的綠色熒光蛋白的表達情況，確認轉染成功后，收集48～72 h病毒上清。3 000 r/min低速離心15 min去除細胞碎片，短期4℃保存備用，長期保存則1 mL分裝，于?80℃保存。

1.2.3重組病毒感染不同來源的細胞

將293T細胞接種于6孔板中，以培養24 h后細胞密度達到 30%～40%為宜。移去培養基，加入收集的病毒上清1 mL，補加1 mL新鮮的完全培養基，并加入Polybrene，使其終濃度為8 μg/mL，感染8 h后，更換為新鮮的完全培養基。感染48 h后熒光顯微鏡下觀察是否可見綠色熒光。病毒成功包裝后，同樣方法分別感染Marc145、MDCK、NIH3T3和RAW264.7細胞，并于48 h后觀察感染情況。

1.2.4過表達hNoc4L的RAW264.7穩定細胞株的構建

將假病毒感染的 RAW264.7細胞通過流式細胞儀進行分選，得到hNoc4L基因過表達的多克隆細胞。將得到的陽性細胞進行培養，并檢測靜息狀態下的不同 RAW264.7細胞株的細胞因子分泌情況，具體檢測方法見1.2.5。培養30 d后，在熒光顯微鏡下觀察穩定細胞株的陽性情況，并通過 Western blotting檢測hNoc4L基因的表達情況。

1.2.5ELISA法檢測RAW264.7穩定克隆株的細胞因子IL-6和TNF-α的分泌

本過程中使用的是達科為生物技術有限公司自主研發的ELISA預包被減步法試劑盒，原理為雙抗體夾心法。步驟為：將104個細胞接種于48孔板，每種細胞設置3個重復。培養8 h后收集細胞上清，按照試劑盒的要求進行操作。以試劑盒配備的標準品制作標準曲線 (0 pg/mL、31.25 pg/mL、62.5 pg/mL、125 pg/mL、250 pg/mL和500 pg/mL)。通過標準曲線計算細胞上清中 IL-6和 TNF-α的含量。以加入100 ng/mL LPS刺激的RAW264.7細胞作陽性對照。

1.2.6Western blotting檢測目的基因hNoc4L的表達情況

用裂解緩沖液 (0.5% NP-40的PBS，含蛋白酶抑制劑混合物) 裂解細胞，離心取上清，加入上樣緩沖液 (含DTT)，100℃處理5 min；各取15 μL上樣進行 SDS-PAGE 電泳 (80 V，30 min；120 V，1 h)；轉膜 (200 mA，1 h)；含5%脫脂奶粉的TBS封閉1 h，加入含有anti-Flag (1∶1 000) 的封閉液搖動1～2 h；用 TBST (含0.5‰ Tween-20) 洗 3次；用含有IgG-HRP (1∶5 000) 的封閉液搖動1 h；用TBST洗3次；將膜晾干，加顯色液于膜上，用封口膜將膜包住放入暗盒內，加入X光膠片，進行曝光、顯影和定影。

2 結果

2.1 真核表達載體pll3.7-EF1以及hNoc4L基因特異性表達的重組慢病毒載體的構建與表達：

以pEF-BOS為模板，將PCR擴增出的EF1α片段插入到pMD-18T載體上，雙酶切得到的陽性克隆質粒，回收目的片段，在將其插入到 pll3.7載體的XbaI和XhoI之間，所挑取的克隆經XbaI和XhoI雙酶切鑒定，切出約1 184 bp的條帶，構建的慢病毒表達載體pll3.7-EF1經測序鑒定正確。以pcDNA3.0-hNoc4L-Flag為模板酶切出的hNoc4L-Flag-his6片段插入到pll3.7-EF1α的XbaI和XhoI之間，所挑的陽性克隆經酶切得到約1 592 bp的片段，與目的片段大小相符，且測序正確。由于pll3.7-EF1-hNoc4LFlag包含有由CMV啟動子啟動的GFP基因，因此，可以通過熒光顯微鏡觀察重組質粒的轉染效率及重組病毒的感染效率。將構建成功的載體用PEI法瞬時轉染293T細胞，24 h后，在熒光顯微鏡下能觀察到大部分細胞都被成功轉染重組質粒，收集已成功轉染的293T細胞，并通過Western blotting檢測到hNoc4L基因的成功表達(圖2)。

圖2 重組質粒載體的構建與表達鑒定Fig.2 The construction and expression of recombinant plasmids. (A) Double digestion of recombinant plasmids pll3.7-EF1 (M1:marker DL2000; M2: marker 1 kb DNA ladder; 1?5: five repeats). (B) pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag (M1: marker DL2000; M2: marker 1 kb DNA ladder; 1?3: three repeats). (C) Transfecting pll3.7-EF1-hNOC4L-Flag in 293T cells. (D) Western blotting analyze ofhNOC4Lgene (lane 1: pll3.7-EF1 in 293T cells; lane 2: pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag in 293T cells).

2.2 重組慢病毒的包裝及鑒定

將重組表達型慢病毒載體 pll3.7-EF1-hNoc4LFlag和病毒包裝質粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共轉染293T細胞，24 h后可觀察到綠色熒光蛋白的表達，且轉染效率較高 (數據未顯示)。繼續培養細胞，72 h后收集病毒上清，并感染293T細胞，將已感染的細胞培養48 h后在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，說明重組慢病毒已成功生產 (圖 3)。將同一視野自然光和熒光下的圖片進行比對發現，重組慢病毒載體可以高效感染293T細胞。

圖3 重組慢病毒對不同細胞的感染后觀察EGFP的表達Fig.3 EGFP expression after transducing recombinant lentiviral construct into the mammalian cell lines of choice under light microscope and fluorescence microscope.

2.3 慢病毒假病毒對不同細胞的感染結果

近年來，一些研究表明，索氏的“語言”實際上是科學主義的產物[20-21]。所謂科學主義，是指主張把自然科學的方法應用于人文社會科學在內的一切研究領域的觀點。科學研究往往需要去除各種“雜質”的影響，索緒爾的語言學理論中含有科學主義的因素，他提出的變革方法就是要開展一場“同質化”運動”[22]364。這里我們有必要深究兩個問題：(1)社會科學為什么要去除雜質，開展同質化運動？(2)社會科學是如何去除雜質，達到同質化這一目的的？

為了進一步檢驗重組慢病毒表達載體對不同細胞的感染情況，用收集的病毒分別感染 4種不同物種來源的細胞系：猴腎細胞 Marc145、狗腎細胞MDCK、小鼠成纖維細胞 NIH3T3和小鼠巨噬細胞RAW264.7。感染 48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察發現這 4種細胞均可見綠色熒光 (圖 3)，說明包裝出的慢病毒能成功感染目標細胞，其中 Marc145、MDCK及 NIH3T3細胞有較高的感染效率，而RAW264.7細胞感染效率較低。

2.4 過表達hNoc4L基因的 RAW264.7穩定細胞系的構建以及細胞特性的鑒定

感染重組病毒的RAW264.7細胞經過3周的培養后，通過流式細胞儀分選，得到了hNoc4L基因過表達的穩定細胞系 (圖4)。RAW264.7細胞是小鼠巨噬細胞系，有外界刺激時會釋放大量的炎癥因子。為了了解病毒感染 RAW264.7細胞是否會引起細胞強烈的免疫原性，我們用ELISA法檢測了RAW264.7細胞及 hNoc4L過表達的穩定細胞系靜息狀態的細胞因子IL-6和TNF-α的分泌情況 (表1)。結果顯示，與沒有感染病毒的RAW264.7細胞相比，重組慢病毒感染的 RAW264.7細胞 (包括 RAW264.7-pll3.7-EF1及 RAW264.7-pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag) 的 TNF-α 和IL-6的含量都沒有升高，表明構建的重組病毒沒有引起 RAW264.7細胞發生明顯的免疫反應。為了檢測hNoc4L基因在細胞中的持續表達情況，我們將上述細胞株連續培養30 d后收集該細胞，用Flag抗體檢測hNoc4L蛋白的表達，在約57 kDa大小處檢測到特征帶，符合預期大小，說明hNoc4L基因成功地穩定表達 (圖 5)。用熒光顯微鏡觀察，同一視野自然光和熒光對比發現細胞的陽性率無明顯改變 (數據未顯示)。

圖4 穩定表達hNoc4L基因的RAW264.7細胞系Fig.4 Stable expression ofhNoc4Lgene in RAW264.7 cell line.

表1 ELISA檢測 RAW264.7和hNoc4L穩定細胞系的IL-6和TNF-α分泌情況Table 1 Determination of IL-6 and TNF-α of different cell lines by ELISA

圖5 Western blotting檢測穩定細胞系中hNoc4L基因的表達Fig.5 Western blotting assay ofhNoc4Lgene in stable cell lines of RAW264.7. 1: pll3.7-EF1 in RAW264.7 cells; 2:pll3.7-EF1- hNoc4L-Flag in RAW264.7 cells.

3 討論

細胞生長和繁殖的快慢取決于細胞內蛋白質合成的速率，而蛋白質合成的速率又取決于核糖體的生成和核糖體RNA基因的轉錄速率，由此可知，核糖體的生物合成對細胞的生長有著決定性的作用。核糖體的生物合成是一個極其復雜的過程，在基因結構水平上，核糖體RNA基因通常以多拷貝的形式存在于染色體上形成串聯重復單位序列，這些序列上還包含了一些重要的順式調控元件，配合著一些反式調控因子調控核糖體RNA基因的轉錄；在核糖體的大小亞基的成熟過程中，反式作用因子也發揮著重要的作用，如核酸酶對pre-rRNA非編碼序列的切除、SnoRNP對35S pre-RNA的假尿嘧啶化和甲基化修飾、RNA螺旋酶和RNA分子伴侶介導的RNP折疊和改構、GTPase和 ATPase催化的蛋白質的聚合和解聚合過程等[7,11-13]。在以酵母為模式生物對核糖體生物發生的調控機制進行研究的過程中不斷有新的發現。在釀酒酵母S. cerevisiae中，Noc類蛋白復合物是一類影響核糖體大小亞基裝配和核運輸的重要的反式調控因子，但其在哺乳動物中的功能未知。因此研究Noc類蛋白在哺乳動物的核糖體生物合成中的作用是十分重要的，本實驗選擇了hNoc4L蛋白為研究對象。

在實驗研究中，常用的病毒載體有腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒載體等。腺病毒可以攜帶大DNA片段并能轉染多種細胞，但轉染效率較低，有較高的抗原性和毒性，只能短暫表達目的蛋白[14]；而慢病毒屬于逆轉錄病毒的一種，基于 HIV-I型病毒構建的慢病毒載體可以高效感染處于分裂期和非分裂期的細胞，能夠攜帶大片段基因，且不易誘發宿主免疫反應，更重要的是能將目的基因高效整合到宿主細胞染色體中，不易引起插入突變，理論上能夠在細胞內永久表達并在子代中穩定表達[15]，而且改造后的慢病毒假病毒沒有復制能力，具有較好的生物安全性，是一種理想的基因轉移載體[16]。因此，本研究選擇慢病毒載體作為特異性表達hNoc4L基因的載體。

慢病毒載體的另一個優點是有廣泛的細胞感染譜，為了檢測我們所獲得的重組慢病毒載體的感染效果，我們感染了不同來源的細胞株，發現其能高效感染來源于人、鼠、犬等不同物種的細胞系。MDCK細胞和Marc145細胞的常規轉染效率不高，約在5%～20%之間；而利用本實驗中構建的載體，可以達到70%以上的陽性率，因此使用該載體可以方便地解決不易轉染的細胞系的外源基因難以高效導入的問題。

RAW264.7細胞是小鼠的巨噬細胞，當有外界刺激時，該細胞極易分化，外形由正常狀態下的圓球形向不規則的形狀轉變，并且伴隨有炎癥因子的釋放，所以可以用來檢測我們所構建的hNoc4L基因特異性表達載體的免疫原性。實驗數據表明，該載體通過感染進入細胞后，并沒有引起細胞形狀的改變，也沒有造成強烈的免疫反應。此外，RAW264.7細胞也是一種極難利用常規化學試劑轉染的細胞，常用的方法就是電轉，而電轉是瞬時轉染，成本高，轉化后的細胞又容易分化。我們所獲得的hNoc4L基因特異性表達的載體因其帶有EGFP標簽，可以通過 FACS分選得到陽性細胞，又加之慢病毒載體可以通過本身具有的5′LTR和3′LTR穩定整合到細胞基因組中并長期表達，因此免去使用抗生素篩選穩定克隆所需的較長的時間周期。實驗結果也表明，我們所獲得的穩定細胞系能夠長期穩定表達hNoc4L基因。

綜上所述，本研究成功構建了hNoc4L基因特異性表達的重組慢病毒載體，該載體具有高效、長期穩定表達和免疫原性低的特點，為后續研究hNoc4L蛋白在哺乳動物核糖體生物發生中的調控作用奠定了基礎。

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Construction and identification of recombinant lentiviral vector ofhNoc4Lgene

Tingting Wang1,2, Shujuan Wang3, and Jinghua Yan1

1CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Science,Beijing100101,China
2Graduate University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China
3China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao266032,China

Received:April 23, 2010;Accepted:May 11, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30870118).

Corresponding author:Jinghua Yan. Tel: +86-10-64807569; Fax: +86-10-64807598; E-mail: yanjh@im.ac.cn

國家自然科學基金項目 (No. 30870118) 資助。