植物類型III聚酮合酶超家族基因結構、功能及代謝產物

馬蘭青，師光祿，葉和春，劉本葉，王有年

1 北京農學院 農業部都市農業 (北方) 重點開放實驗室，北京 102206

2 中國科學院植物研究所 中國科學院光合作用與環境分子生理學重點實驗室，北京 100093

綜 述

植物類型III聚酮合酶超家族基因結構、功能及代謝產物

馬蘭青1，師光祿1，葉和春2，劉本葉2，王有年1

1 北京農學院 農業部都市農業 (北方) 重點開放實驗室，北京 102206

2 中國科學院植物研究所 中國科學院光合作用與環境分子生理學重點實驗室，北京 100093

植物聚酮類化合物主要包括酚類、芪類及類黃酮化合物等，在植物花色、防止紫外線傷害、預防病原菌、昆蟲危害以及作為植物與環境互作信號分子方面行使著重要的生物學功能。該類化合物具有顯著多樣的生物學活性，對人體保健及疾病治療有顯著意義。植物類型III 聚酮化合物合酶 (PKS) 在該類化合物生物合成起始反應中行使著關鍵作用，決定該類化合物基本分子骨架建成和代謝途徑碳硫走向，為合成途徑關鍵酶和限速酶。以查爾酮合酶為原型酶的植物類型III PKS超家族是研究系統進化和蛋白結構與功能關系的模式分子家族，目前已經分離得到14種植物類型IIIPKS基因，這些同祖同源基因及其表達產物既有共性，也表現出許多獨特個性，這些個性賦予此類次生代謝產物結構上的多樣性。以下綜述了植物類型III PKS超家族基因結構、功能及代謝產物研究進展。

聚酮合酶，查爾酮合酶，次生代謝

Abstract:Plant-specific type III polyketide synthase (PKS) produces a variety of plant secondary metabolites with notable structural diversity and biological activity. So far 14 plant-specific type III PKS have been identified according to their enzymatic products, and the corresponding genes have been cloned and characterized. The differences among the various PKS are mainly in their substrate specificities, the number of their condensation reactions, and the type of ring closure of their products. However,numerous studies have revealed the common features among the plant-specific type III PKS, which include sequence homology,similar gene structure, conserved amino acid residues in the reaction center, enzymatic characteristics and reaction mechanism. We briefly reviewed 14 plant-specific type III PKS to better understand genetic and metabolic engineering of plant-specific type III PKS.

Keywords:polyketide synthase, chalcone synthase, secondary metabolism

聚酮類化合物 (Polyketide，PK) 是由細菌、真菌、放線菌及植物產生的一大類次生代謝產物，主要包括大環內酯類、四環素類、蒽環類、聚醚類、酚類、芪類以及類黃酮化合物等。由于生物合成途徑及機制復雜多變，造成聚酮化合物數量和分子結構極其龐大繁雜，從而使該類化合物具有顯著多樣的生物學活性。微生物來源的聚酮化合物家族包括了大多數抗生素和一些重要藥物 (抗癌藥、免疫抑制劑等)。如臨床上已經應用的紅霉素、四環素、利福霉素、兩性霉素、阿霉素、洛伐他丁、FK506、雷帕霉素等重要抗生素，以及農牧業上使用的阿弗菌素和莫能星、泰樂菌素等都屬于這個家族[1]。植物聚酮類化合物主要包括酚類、芪類以及類黃酮化合物等，其中，眾多化合物具有抗腫瘤、心血管保護、抗氧化功能[2-3]。目前，來源于聚酮化合物的藥物每年銷售額已超過100億美元。

聚酮化合物雖然種類繁多、結構多變，但其生物合成有著共同的機制，均由聚酮化合物合酶(Polyketide synthase，PKS) 催化合成。目前發現的PKS大體上可分為3類：I型PKS是以模塊形式存在的多功能酶，每一模塊含有一套獨特的、非重復使用的催化功能域，主要催化合成大環內酯、聚烯及聚醚類化合物；II型PKS是含有一組可重復使用單元的多酶復合體，主要催化芳香族聚酮化合物的生物合成，I型和II型PKS主要存在于微生物中；III型PKS屬于查爾酮合成酶 (Chalcone synthase，CHS) (EC 2.3.1.74) 類，主要存在于植物和細菌中，是一種可重復使用的同源雙亞基蛋白，主要負責單環或雙環芳香類聚酮化合物的生物合成[1]。本文主要針對植物類型III PKS超家族基因結構、功能及代謝產物進行分析。

1 植物類型III PKS超家族成員

CHS普遍存在于植物中。1972年，CHS的體外酶促活性首次在歐芹懸浮細胞培養物中被發現[4]。1983年首個CHS的基因序列從歐芹中被克隆[5]。漫長的進化過程中，CHS基因在不同植物譜系中發生了不同程度的重復和分化，導致在多數植物基因組中存在具不同表達特性的CHS重復基因，并在部分植物基因組中出現由CHS基因分化形成的具有新的底物選擇性和產物特異性的“類CHS(CHS-Like)”基因[6]。這些結構相似、功能相關、但表達模式及編碼產物催化特性有一定差異的基因組成了一個龐大的基因家族——查爾酮合酶基因超家族 (Chalcone synthase superfamily)，又稱為植物類型III PKS基因超家族 (Plant-specific type III polyketide synthase superfamily)。

目前，已經從苔蘚、蕨類、裸子和被子植物中分離了14種植物類型IIIPKS基因。這些不同PKS的差別主要體現在起始底物特異性、縮合反應次數(聚酮鏈延伸長度) 以及產物合成所使用的不同環化方式等。這些PKS的名稱、催化方式見表1。以細菌類型III PKS為外類群的系統發育分析結果表明，植物類型III PKS按照苔蘚、蕨類，裸子和被子植物分類，每一類型植物中的 CHSs和功能異化的類型III PKS (CHS-like) 分別構成獨立的組群 (圖1)[10]。

2 植物類型III PKS超家族基因結構

植物類型 III PKS超家族不同成員具有許多共同特征，主要包括基因結構、序列相似性、活性中心、酶學性質以及共同的催化機制等[6-7]。保守的基因結構是高等植物類型IIIPKS的一個共同特征。顯花植物 (裸子植物和被子植物) 中，除一個早期報道的金魚草Antirrhinum majusCHS(AMCHS) 含有2個內含子 (Intron) 外[7]，迄今20余年研究中，所有報道的類型IIIPKS基因均含有1個內含子且該內含子位置保守[3,8]。金魚草AMCHS兩個內含子中，第一內含子的位置與其他基因相同，第二內含子位于第二個外顯子 (Exon) 內部，Sommer和 Saedler[7]推測第二內含子是在金魚草這一物種形成后獲得的。然而作者及后續的研究并未對AMCHS的基因特性、表達特性及 AMCHS酶學性質，具體功能作進一步的研究，也沒有金魚草及其相關科屬植物中類型IIIPKS超家族其他成員基因結構方面的報道。

有趣的是，在我們工作中2個含有3個內含子的類型IIIPKS基因 (PcPKS1，經系統發育和功能研究證明其編碼產物為具有雙酶活性的 CHS；PcPKS2，經過分析確認其編碼產物為苯亞甲基丙酮合酶，Benzalacetone synthase，BAS) 相繼從虎杖Polygonum cuspidatumSieb. et Zucc中被分離和鑒定，3個內含子在上述 2個基因中的插入位置完全保守[9-10]。與PcPKS1和PcPKS2內含子2相比，金魚草AMCHS第二個內含子的插入位置相對保守，向前移動了一個堿基[9-10]。PcPKS1和PcPKS2的 3個內含子之間沒有發現顯著的相似性[9-10]。迄今為止，CHS是高等植物中最共同和分布最廣泛的類型IIIPKS，所有已經得到功能驗證的植物類型IIIPKS超家族其他成員 (CHS-like) 都來自于CHS廣泛重復和后續的遺傳變異[2]。除了PcPKS1和PcPKS2，我們進一步的工作發現在虎杖中存在一個含有 1～2個內含子基因組成的植物類型IIIPKS基因家族。其中包括一個單內含子CHS基因 (EU647246)、一個單內含子CHS-like基因 (DQ459349)、一個雙內含子CHS-like基因 (EU647245)。考慮到PcPKS1和PcPKS23個內含子保守的插入位點以及系統發育分析結果 (圖 1)，我們推測虎杖中PcPKS2極有可能通過一個單基因重復事件從一個 3內含子CHS(PcPKS1) 進化而來[10]。隱花植物中，新近一項研究也發現了植物類型IIIPKS超家族特殊的基因結構，新型模式植物小立碗蘚Physcomitrella patens假定的19個類型 IIIPKS基因中，有 6個不含內含子，4個含有1個內含子，而剩余的基因含有2個內含子[11]。苔蘚植物大約在 4.5億年前從維管植物的祖先中分離出來[11]，因此類型IIIPKS非正常的基因結構在顯花植物和隱花植物中都是存在的。植物β-酮酯酰合酶 (β-ketoacyl synthases，KS) 被認為是植物類型 III PKS的祖先，大部分的β-酮酯酰合酶在其編碼區不含內含子[12]。目前，還沒有類型IIIPKS基因內含子功能方面的報道。然而一些研究表明，內含子對于植物基因的功能是有作用的[13]。近些年來，雖然類型III PKS的家族成員不斷從各種植物中被鑒定，但對該家族基因的基因組分布狀況知之甚少。植物類型 III PKS在基因組水平上復雜的進化變化極有可能是不斷適應產生具有植物種屬特性化學信號的結果。因此非正常的基因結構也極有可能存在于那些已經經過功能鑒定的類型 IIIPKS超家族其他成員(CHS-like) 基因中。進一步的工作需要闡明植物類型 IIIPKS多內含子基因結構在高等植物中的分布狀況。

表1 植物類型III PKSs超家族成員Table 1 Plant-specific type III polyketide synthase superfamily

圖1 植物類型III PKS超家族成員系統發育分析結果 (以細菌類型III PKS為外類群，用于系統發育分析的基因序列接收號及分析方法見文獻[10])Fig.1 Neighbor-joining tree of type III PKS. Numbers at the forks are bootstrap values from 100 replicates. Four bacterial type III PKS were used to root the tree. The accession numbers used in the analysis were as previously described[10].

3 植物類型III PKS超家族酶功能及其次生代謝產物

植物類型 III PKS超家族成員底物選擇和催化機制非常復雜，主要體現在 3個方面：一是超家族中不同酶有不同的主產物；二是家族中的很多成員都有著非常寬泛的起始底物特異性；三是體外酶促反應中，會產生相當數量的早期脫軌產物——副產物，如 2步縮合反應丙烯酮-中間體副產物Bisnoryangonin (BNY)，3步縮合反應丁烯酮-中間體副產物4-Coumaroyltriaceticacid lactone (CTAL)，在特定條件下，副產物的量有時會超過主產物的量。植物聚酮類化合物主要包括酚類、芪類以及類黃酮化合物等。其中，大部分聚酮類化合物生物合成途徑機制尚不明確，但可以肯定的是植物類型III PKS在聚酮化合物生物合成起始反應中行使著關鍵的作用，決定著化合物基本分子骨架的建成和代謝途徑碳硫走向，是植物聚酮化合物生物合成途徑的關鍵酶和限速酶。作為重要的植物次生代謝產物，植物聚酮類化合物及其衍生物在植物色彩、防止紫外線傷害、預防病原菌、昆蟲危害以及作為植物與環境之間互作的重要信號分子方面行使著重要的生物學功能。

植物類型III PKS超家族中，目前研究最為透徹的是查爾酮合酶，其催化來自丙二酰輔酶 A(Malonyl-CoA) (類型III PKS“延伸”底物) 的3個乙酰集團通過連續的縮合反應連接到 4-香豆酰輔酶A (p-Coumaroyl-CoA) (類型 III PKS“起始”底物) 分子上，之后通過克萊森 (Claisen) 型環化反應生成芳香族聚酮化合物柚皮素查爾酮 (Naringenin chalcone)，其為類黃酮化合物生物合成的前體(圖 2) 。類黃酮化合物廣泛存在于高等植物中，在植物體內絕大部分以糖甙的形式轉運和貯存[14]，與植物的花色形成密切相關，并在植物與環境的相互作用中起重要作用，如防止紫外線 (UV) 損傷、抗蟲、抗病、影響豆科植物的根瘤形成等[2-3]。眾多研究結果表明，查爾酮衍生物 (即類黃酮化合物) 對人體健康和疾病治療具有積極效果[2-3]。

植物類型 III PKS超家族的酶都是由分子量為40～45 kDa大小適中亞基組成的同型二聚體，活性位點為 Cys164、His303和 Asn336，這 3個在植物類型 III PKS超家族中絕對保守的氨基酸組成了該類酶的活性中心 (三聯體活性中心)：“起始底物分子結合結構域”和“環化反應結構域”。紫花苜蓿Medicago sativaCHS晶體結構和定點突變的研究結果揭示了CHS催化柚皮素查爾酮形成機制和過程：1) 起始分子定位于 Cys164位點；2) 丙二酰-CoA脫羧生成乙酰-CoA；3) 聚酮化合物鏈開始延伸；4)丁烯酮-中間體-CHS復合物完成環化和芳構化[15]。此外，CHS活性位點還包括Val98、Thr132、Ser133、Met137、Gly163、Thr194、Gly211、Gly216、Ile254、Ser338、Pro375，以及CHS“門衛”氨基酸Phe215和 Phe265[2]。植物類型 III PKS超家族其他成員酶(CHS-Like) 功能的多樣性來自原型酶——CHS活性位點的小的修飾，這些小的變動改變了起始底物的選擇性、鏈延伸的長度和環化反應機制 (表1、圖2)。

3.1 苯亞甲基丙酮合酶 (BAS)

苯亞甲基丙酮合酶 (BAS) 使用與CHS相同的底物，但產物卻存在很大差異。掌葉大黃Rheum palmatumBAS一個顯著特點是 Phe215 (M. sativaCHS順序)被Leu取代，定點突變實驗結果表明，這個位置上的取代對于該酶的BAS活性是必需的，該位置上 Phe被替換，致使聚酮鏈的延伸在乙烯酮中間體階段即被打斷 (表1、圖2)[16]。Austin和Noel[2]認為CHS“門衛”Phe、Phe215和Phe265可能調節類型III PKS活性位點與輔酶A (CoA) 結合通道之間的空間結構。我們的研究證實，PcPKS2同樣是一個 BAS，有趣的是，Phe215和 Phe265在 PcPKS2中雙雙缺失，分別被Leu和Cys取代，導致聚酮鏈的延伸在乙烯酮中間體階段提前結束 (圖2)。另一個非常有趣的結果同樣出現在我們的研究中，經序列及系統發育分析表明，PcPKS1是一個典型的CHS，然而，功能和酶學分析結果顯示 PcPKS1是一個同時擁有 CHS和 BAS活性的雙功能酶，且PcPKS1的 BAS活性催化效率 (Kcat/Km) 比PcPKS2高70倍[10]。BAS在構建具有重要藥理價值一系列苯丁烷類化合物 (Phenylbutanoids) 及其衍生物的 C6–C4分子骨架方面具有重要的功能。目前這些苯丁烷類化合物主要包括大黃中的林氏蓮花掌素甙 (Glucoside lindleyin)、生姜中的姜酚(Gingerol) 和姜黃 (Curcumin)[17]，以及覆盆子果實中一種獨特的芳香物質覆盆子酮 (Raspberry ketone)[17]。

3.2 4-香豆酰甘油酸合酶 (CTAS)

八仙花Hydrangea macrophyllavar.thunbergii4-香豆酰甘油酸合酶 (p-Coumaroyl triacetic acid synthase，CTAS) 催化4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A分子間3步連續的縮合反應，但CTAS缺乏必要的環化機制，導致其催化產物為線性丁烯酮中間體副產物——CTAL[18](表1、圖2)。序列分析顯示，在CTAS中，CHS活性位點Thr197被Asp取代，同時在相當于M. sativaCHS第290位氨基酸殘基位置上有6個氨基酸殘基的插入[2]。CTAS產物CTAL的衍生物Hydramacroside B存在于八仙花葉片中，是一種重要的植物抗毒素[19]。

3.3 芪合酶 (STS)

芪合酶 (Stilbene synthase，STS) 能夠利用與CHS相同的底物催化合成相同的丁烯酮-中間體產物，然而后續步驟中，二者環化反應機制存在差異，CHS運用分子內克萊森型縮合反應機制催化丁烯酮-中間體分子C6和C1位置進行縮合連接生成柚皮素查爾酮；而 STS則運用分子內醛醇縮合 (Aldol condensation) 反應機制催化丁烯酮-中間體分子 C7和 C2位置進行縮合連接生成白藜蘆醇(Resveratrol)，且伴有 C1位置脫羧反應 (表 1、圖2)。后續研究顯示，STS與CHS之間具有顯著的序列相似性[20]，除不同的環化反應機制外，二者之間沒有發現其他反應機制的差別[21]。隨著STS從松樹(裸子植物)[22]和葡萄 (被子植物)[23]相繼克隆促進了STS與CHS之間的系統發育分析，結果顯示二者在氨基酸水平存在60%～90%的同一性，在34個CHS和4個STS的系統發育分析中，STS沒有單獨聚合，而是與相同或相關植物的CHS聚合，該研究結果說明 STS從 CHS多次進化而來。有趣的是，將花生Arachis hypogaeaSTS和野葛Pueraria lobataCHS cDNA分別在大腸桿菌中表達，它們的表達產物存在著部分重疊，即在 CHS催化產物中有白藜蘆醇(約為柚皮素查爾酮的2.7%～4.2%)，而在STS催化產物中含有有柚皮素查爾酮 (約為白藜蘆醇量的1.4%～2.3%)[24]。被子植物STS產物白藜蘆醇是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，是在植物受到病原性進攻和環境惡化時產生的一種植物抗毒素，廣泛存在于種子植物中。花生、葡萄的STS在煙草、苜蓿中異源過表達后，上述兩種植物的抵抗真菌能力顯著增強[25]。白藜蘆醇不僅是一種重要的植物抗毒素，還具有眾多的藥理和保健功能，主要包括：抗癌作用；心血管保護作用；抗氧化、抗自由基作用；神經保護作用；消炎作用；抗真菌作用；機體損傷的保護作用；植物雌激素作用；對骨代謝和內皮素拮抗劑的影響等。其中，最令人矚目和具有發展前景的是其在抗腫瘤、心血管保護、抗氧化方面的作用[26]。裸子植物 STS由于使用不同的起始底物肉桂酰輔酶A (Cinnamoyl-CoA)，其產物為銀松素 (Pinosylvin)，也是一種重要的植物抗毒素。

3.4 聯芐合酶 (BBS)

聯芐合酶 (Bibenzyl synthase，BBS) 的催化方式與STS完全相同，只是起始底物有所差異。BBS使用聯芐-m-香豆酰輔酶 A (dihydro-m-Coumaroyl-CoA) 為起始底物，催化來自丙二酰輔酶A的3個乙酰集團通過連續的縮合反應連接到起始底物分子上，并運用分子內醛醇縮合反應機制催化中間體分子 C7和 C2位置進行縮合連接生成聯芐-芪產物(Dihydrostilbene)——3,3'5-Trihydroxybibenzyl，且伴有 C1位置脫羧反應 (表 1、圖 2)[27]。基于 BBS序列結構的實驗結果顯示，CHS保守位點 Met137、Val98和Gly211分別被Leu、Ala和Thr取代有可能直接影響BBS起始底物的選擇性[2]。在脅迫或傷處理蘭花組織時，特別是傷口感染內生菌根菌的情況下，聯芐-芪類化合物及其三環衍生物——9,10-Dihydrophenanthrenes開始大量積累，推測聯芐化合物為一種植物抗真菌植保素[2]。

3.5 芪-羧酸酯合酶 (STCS)

芪-羧酸酯類化合物存在于八仙花屬(Hydrangea)、苔類 (Liverworts)、大麻類植物(Cannabis) 以及毒常春藤 (Poison ivy) 中，它們中的許多化合物擁有非常有價值的特性，如葉甜素(Phyllodulcin) 的甜味超過蔗糖600～800倍[28]。從該類化合物分子結構判斷，其前體極有可能起源于類型III PKS的催化，然而在體外環境下，至今沒有該類化合物完整的合成途徑得到確認和證明[2]。但在上述植物中，不斷有催化該類反應新的類型III PKS被驗證。例如，八仙花Hydrangea macrophylla芪-羧酸酯合酶 (Stilbenecarboxylate synthase，STCS)的催化方式與STS、BBS的差別主要體現在最適起始底物和脫羧反應機制上，STCS以聯芐-4-香豆酰輔酶A (Dihydro-4-Coumaroyl-CoA) 為起始底物，催化來自丙二酰輔酶A的3個乙酰集團通過連續的縮合反應連接到起始底物分子上，并運用分子內醛醇縮合反應機制催化中間體分子C7和C2位置進行縮合連接生成5-Hydroxylunularic acid，值得關注的是，其C1位置未發生脫羧反應 (表1、圖2)[29]。

3.6 吖啶酮合酶 (ACS)

蕓香科植物 (Rutaceae) 具有三環結構吖啶酮分子的基本骨架是由吖啶酮合酶 (Acridone synthase ACS) 催化合成的。ACS催化來自丙二酰輔酶A的3個乙酰集團通過連續的縮合反應連接到特異起始底物 N-甲基鄰氨基苯 (甲) 酰輔酶 A(n-Methylanthraniloyl-CoA) 分子上，之后通過克萊森 (Claisen) 型環化反應生成吖啶酮化合物——1,3二甲基-N-甲基吖啶酮 (1,3-dihydroxy-N-methylacridone) (表1、圖2)[30]。蕓香科植物不論是CHS還是STS在體外條件下都不能利用N-甲基鄰氨基苯 (甲) 酰輔酶A作為起始底物，而野生型的ACS卻可以利用4-香豆酰輔酶A合成柚皮素查爾酮，其活性是以N-甲基鄰氨基苯 (甲) 酰輔酶A為起始底物的15%[31]。像其他類型III PKS一樣，ACS氨基酸序列中有近 100處與 CHS有所差異，其中 ACS三聯體突變體 (T132S/S133A/F265V) 能夠明顯降低ACS利用N-甲基鄰氨基苯(甲)酰輔酶A為起始底物的能力，卻能夠顯著增加對4-香豆酰輔酶A的親和性[32]，這3個氨基酸對于ACS相對于CHS的活性變化非常重要，然而，ACS三聯體突變體 (T132S/S133A/F265V) 仍然能保持一定吖啶酮合成能力的事實說明，仍然有其他一些重要的位點對于ACS功能有作用[32]。目前已知的近百種吖啶酮生物堿大部分特異地分布在蕓香科植物家族中，近期也有報道在胡椒科 (Piperaceae) 植物中發現了這類化合物[30]。該類化合物屬于生物堿植物抗毒素，同時具有許多誘人的生物學活性，但由于其干擾DNA合成，其在醫學治療方面的作用受到限制[33]。

3.7 二苯甲酮合酶 (BPS) 和聯苯合酶 (BIS)

我們對二苯甲酮合酶 (Benzophenone synthase，BPS)[34]和聯苯合酶 (Biphenyl synthase，BIS)[35]酶學性質及功能研究結果表明，BPS和BIS之間的功能關聯與CHS和STS之間的關系完全相同，只是起始底物有所差別。CHS和STS使用4-香豆酰輔酶A，而BPS和BIS使用苯甲酰輔酶A (Benzoyl-CoA) 為起始底物。BPS催化來自丙二酰輔酶A的3個乙酰集團通過連續的縮合反應連接到苯甲酰輔酶A分子上，之后通過克萊森型環化反應機制生成Phlorbenzophenone。而BIS則能夠利用與BPS相同的底物催化合成相同的中間體產物，后續環化反應中，BIS運用分子內醛醇縮合 (Aldol condensation) 反應機制生成3,5-二羥基聯苯 (3,5-Dihydroxybiphenyl)，且伴有C1位置脫羧反應 (表1、圖2)。BPS是合成苯甲酮 (Benzophenones) 和 (夾) 氧二苯甲酮(Xanthones) C13基本骨架的關鍵酶，苯甲酮衍生物為天然酚類化合物，具有誘人的藥理學特性，如Guttiferone F具有很強的抗HIV和抗微生物活性[36]。BIS是合成聯苯化合物 (Biphenyls) 的起始酶[35]。聯苯化合物是薔薇科 (Rosaceae) 蘋果亞科(Maloideae) 中一類植物抗毒素，且具有明顯的種屬特性[37]。該類植物包括了溫帶常見的觀賞和食用植物，如蘋果、梨及花楸、山楂等。

3.8 2-吡喃酮合酶 (2-PS)

2-吡喃酮合酶 (2-PS) 克隆于觀賞雛菊Gerbera hybrida。與 CHS不同，2-PS不能利用 4-香豆酰輔酶A，而是利用乙酰輔酶A (Acetyl-CoA) 作為起始底物，其催化來自丙二酰輔酶A的2個乙酰集團通過連續的縮合反應連接到乙酰輔酶A分子上，之后通過內酯化 (Lactone) 反應生成6-甲基-4羥基-2-吡喃酮 (6-methyl-4-hydroxy-2-pyrone) (表 1、圖 2)[37]。在不含乙酰輔酶A的體外酶促體系中，2-PS也可以利用丙二酰輔酶A脫羧后的乙酰輔酶A作為起始底物，只是催化效率下降10倍。以g2ps1為探針，一系列相似酶從觀賞雛菊和其他 4個菊科植物中被克隆。與CHS序列比對結果表明，在被子植物菊科家族產生進化分化之前，2-PS亞家族極有可能通過一個單基因重復事件從一個CHS進化而來[38]。基于紫花苜蓿M. sativaCHS晶體結構同源模擬結果顯示，與 CHS相比，2-PS的催化腔體積較小[39]。定點突變研究結果表明，CHS三聯體突變體(T197L/G256L/S338I) 的功能與2-PS完全相同[40]。2-PS為2種含有還原型甲基吡喃酮基本骨架的化合物 (Gerberin和parasorboside) 提供了前體，這兩種化合物的糖甙及其衍生物存在于多種植物中，具有很好的抑制細菌、真菌和預防昆蟲攝食的作用[37]。體外酶促反應中，2-PS可以利用苯甲酰輔酶 A(Benzoyl-CoA) 為起始底物產生 6-苯基-4-羥基-2-吡喃酮 (6-phenyl-4-hydroxy-2-pyrone)，該化合物結構符合 HIV-1蛋白酶抑制劑家族基本特征，可能具有潛在的功能[37]。

3.9 蘆薈松合酶 (ALS)

掌葉大黃R. palmatum蘆薈松合酶 (Aloesone synthase，ALS) 同樣以乙酰輔酶A為起始底物，以丙二酰輔酶A為延伸底物，值得關注的是，ALS催化2個底物間6步連續的縮合反應，中間產物經環化產生芳香族庚烯酮——蘆薈松 (Aloesone) (表1、圖2)[15]。ALS與CHS保持有60%的氨基酸序列同一性，并且保有幾乎所有的輔酶A結合位點，但在ALS中，CHS活性位點Thr197、Ile254、Gly256和Ser338分別被Ala、Met、Leu和Thr所取代，有意思的是這些氨基酸殘基在2-PS中同樣被取代[41]。基于紫花苜蓿M. sativaCHS晶體結構同源模擬結果顯示，ALS具有與CHS相同的三維結構，但ALS催化腔體積 (1173 ?3) 要明顯大于CHS (1019 ?3) 和2-PS (298 ?3)，此結果暗示著活性中心三維空間體積有可能決定著聚酮化合物鏈延伸的長度。ALS在大黃 (Rhubarb) 中的產物，如 AloesoneO-glucoside(7-O-β-D-glucopyranoside) 和 AloesoneC-glucoside(8-C-β-D-glucopyranoside) 具有很強的消炎活性[15]。

圖2 植物類型III PKSs超家族成員催化反應過程及產物 (環化反應類型及位置在圖中標出，反應機制見表1參考文獻)Fig.2 Comparison of the reactions and products of known divergent plant type III PKSs. The position and type of cyclization reaction (Claisen, aldol, or lactone) of each presumed linear polyketide intermediate is depicted. The reaction mechanism of plant-specific type III PKSs was as described in the references of Table 1.

3.10 苯戊酮合酶 (VPS)

啤酒花 (Humulus lupulus，hops) 苯戊酮合酶(Valerophenone synthase，VPS) 以脂肪酰輔酶A——異戊酰基或異丁酰基輔酶 A (Isovaleryl-或 Isobutyryl-CoA) 為起始底物，以丙二酰輔酶 A為延伸底物，催化2個底物間3步連續的縮合反應，中間產物經克萊森型環化反應生成 Phlorisovalerophenone或Phlorisobutyrophenone。有趣的是，在體外酶促反應中，CHS可以接受異戊酰基-CoA為起始底物，其產物為 Phlorisovalerophenone和一個丙烯酮內酯副產物的混合物，而VPS卻不能利用CHS香豆酰輔酶A作為起始底物[42]。VPS與CHS氨基酸序列比對結果表明，二者在鄰近CHS“起始底物結合結構域”周圍存在許多有意思的差異，CHS中保守的 Thr132和Thr197，在啤酒花VPS中分別被Gly和Ile取代。第 2個 VPS發現于原始維管植物松葉蕨Psilotum nudum中，其在132和197位置上都為Ser，且CHS和啤酒花VPS中保守的Ser338在松葉蕨VPS中被Val取代[2]。VPS在啤酒花中的代謝產物，一系列苦味酸物質，如蛇麻烯 (Humulone) 和蛇麻酮(Lupulone) 賦予啤酒獨特的口味[2]。

3.11 戊烯酮-色酮合酶 (PCS) 和辛烯酮合酶(OKS)

戊烯酮-色酮合酶 (Pentaketide chromone synthase，PCS) 能夠催化丙二酰輔酶 A分子間連續 4步的縮合反應產生 5,7-dihydroxy-2-methylchromone[43]，而辛烯酮合酶 (Octaketides synthase，OKS) 則可以催化丙二酰輔酶A分子間連續7步的縮合反應產生芳香族辛烯酮產物——Octaketides SEK4和SEK4b[44]。序列比對結果顯示，OKS與植物類型III PKS超家族其他成員酶保持有50%～60%的氨基酸序列同一性，與 ALS、PCS及 2-PS相同，CHS活性位點Thr197、Gly256和 Ser338分別被其他氨基酸所取代。同源模擬結果顯示，OKS的催化腔體積為(1124 ?3)，適合其完成連續7步的縮合反應。日本蘆薈Aloe arborescensPCS為平喘藥 Kehellin和Visnagin生物合成提供了前體化合物[43]；而來自相同植物的OKS可能為抗生素類藥物辛烯酮提供了前體化合物[44]。

4 總結和展望

植物類型 III PKS超家族成員功能多樣性和底物特異性的冗雜是這個研究領域內公認的。超家族內其他成員酶 (CHS-Like) 功能的多樣性均來自其原型酶——CHS活性位點的小的修飾，這些小的變動影響了該類酶活性中心空間構象，這種空間變化極大改變了酶分子的起始底物選擇性、鏈延伸長度和環化反應機制。因此，揭示植物類型III PKS超家族結構與功能間的關聯，對于利用該類酶進行基因工程、代謝工程遺傳操作是不可或缺的。

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Plant-specific type III polyketide synthase superfamily:gene structure, function and metabolistes

Lanqing Ma1, Guanglu Shi1, Hechun Ye2, Benye Liu2, and Younian Wang1

1Key Laboratory of Urban Agriculture(North)of Ministry of Agriculture China,Beijing University of Agriculture,Beijing102206,China
2Key Laboratory of Phytosynthesis and Environmental Molecular Physiology,Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Beijing100093,China

Received:January 19, 2010;Accepted:June 18, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 30170759, 30571506), Beijing Municipal Natural Science Foundation (No. 6071001),Funding Project for Academic Human Resources Development in Institutions of Higher Learning under the Jurisdiction of Beijing Municipality (Nos.PXM2007-014207-044536, PXM2007-014207-044538).

Corresponding author:Benye Liu. Tel: +86-10-62836244; Fax: +86-10-62836249; E-mail: benyel@ibcas.ac.cn

Younian Wang. Tel/Fax: +86-10-80799006; E-mail: lqma@bac.edu.cn

國家自然科學基金項目 (Nos. 30170759, 30571506)，北京市自然科學基金重點項目 (No. 6071001)，北京市屬高校人才強教計劃 (Nos.PXM2007-014207-044536, PXM2007-014207-044538) 資助。