磷脂酶A 2與高血壓大動脈血管重構關系初步研究*

曹相玫,景 麗△,張建中,孫金萍,安 欣,郭鳳英

(寧夏醫科大學:1.病理系;2.附屬醫院病理科 銀川750004)

高血壓細小動脈重構直接影響高血壓發生、發展,參與導致靶器官結構和功能損害,研究同時表明,大動脈重構在高血壓的發生、發展中也發揮重要作用[1]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖/凋亡失衡是高血壓引起血管重構的主要原因[2]。VSMC增殖/凋亡失衡的機制不清,胞漿型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2)活化后可對細胞的分化和增殖產生調節作用,cPLA2的活化多經絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉導通路中細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路(Ras/Raf/MEK/ERK)進行[3-4],生理狀態下,ERK是M EK的惟一下游底物,MEK和ERK在該通路中具有重要地位。本研究探討高血壓主動脈VSMC中cPLA2的作用以及與ERK 1/2上游激酶MEK的關系,以進一步明確高血壓狀態下大動脈VSMC增殖/凋亡失衡參與血管重構的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)15只,雄性Wistar大鼠(WKY)15只,均購自北京維通利華實驗動物有限公司。單克隆磷酸化兔抗 p-MEK1/2 IgG(Ser2211)抗體(Cell Signaling公司產品),單克隆磷酸化兔抗p-cPLA-2 IgG(P3639 Rb-h)抗體、過氧化物酶標記的鏈霉卵白素法(streptavidin-biotin-peroxidate complex,SABC)免疫組化染色試劑盒(USCNLIFE公司產品),山羊抗兔IgG-HRP(克隆號:04-15-06,KPL公司),PBS緩沖液、多聚賴氨酸、3,3′-二氨基聯苯胺(3,3-diaminobenzidine DAB)試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),預染Marker(蘭州TIANGEN公司),Western一抗稀釋液、RIPA細胞裂解液(武漢碧云天生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物 將15只 SHR分為 4、16、24周齡組,15只WYK作為對照。SHR大鼠出廠時經尾動脈儀測量基礎血壓及心率;所有大鼠均飼養于SP-F級環境中,安靜、正常光照、正常飲食。每周同一時間用BL-420E+生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)測大鼠動脈壓1次,至周齡處死。于處死前,經腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后,經股動脈插管連接二導生理記錄儀測量動物心率(HR)、動脈收縮壓(SAP)、動脈舒張壓(DAP)、平均動脈壓(MAP)等。迅速取出胸主動脈一半置于DEPC處理后的4%中性多聚甲醛溶液(1∶1 000)中固定48 h,用于免疫組化檢測;一半裝入凍存管,投入液氮中迅速冷凍后移置于-80℃冰箱中冷凍,用于Western blot測定蛋白含量。

1.2.2 免疫組化法 采用SP法。操作按照產品說明書進行,選擇推薦的乳腺癌標本作陽性對照、PBS代替一抗作為陰性對照,DAB顯色。

1.2.3 Western-blot檢測 按照蛋白質SDS-PAGE電泳操作步驟進行配膠、電泳、DAB染色及采集圖像。

1.2.4 結果判斷 實驗標本均取自胸主動脈,以其冠狀切面包埋后切片,隨機計數20個高倍視野中的全部 VSMC細胞數,p-cPLA2和p-MEK染色均以胞漿出現棕色或棕黃色顆粒視為陽性細胞。Western blot檢測結果經BIO-RAD生物醫學圖像分析系統對目的顯色條帶進行光密度分析和掃描半定量分析。觀察各實驗組泳道膜上棕黑色目的蛋白帶密度的灰度并進行統計學分析。

1.3 統計學方法 用SPSS11.5統計軟件進行數據統計,兩組間血壓用t檢驗,免疫組化陽性率用χ2檢驗。實驗結果以±s表示,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般狀況 實驗大鼠在實驗期間飲食、活動、體質量增長均正常,無動物死亡現象。圖1為各組大鼠處死時心臟/體質量趨勢圖,WKY的體質量均高于同周齡SHR。SHR的心臟/體質量比值均較同周齡WKY的心臟/體質量比值高,并且隨周齡增加心臟/體質量比值呈增高趨勢。

2.2 血壓變化 實驗期間,各周齡WKY M AP維持在(106.22±11.52)～(110.60±12.50)mm Hg之間。4周齡SHR血壓為(90.25±4.13)mm Hg,8周齡組開始升高,SHR8、SHR16、SHR24明顯高于 SHR4和同周齡 WKY,圖2為SHR血壓隨周齡的增加呈升高趨勢。

2.3 p-cPLA2檢測結果

2.3.1 主動脈VSMC中p-cPLA2免疫組化染色表明p-cPLA2在各組大鼠主動脈VSMC中有不同程度的表達,SHR和WKY均隨周齡增加其表達逐漸增強,SHR表達率低于同周齡WKY(表1),差異有統計學意義(P＜0.01)。SHR24陽性細胞少,陽性細胞著色淡,其分布多接近內皮下和外膜下(圖3a),而WKY 24主動脈各層VSMC均可見較廣泛的表達(圖3b)。

2.3.2 主動脈VSMC中p-cPLA 2經Western blot檢測未檢出,可能由于組織在-80℃冰箱放置時間過長,同時裂解過程處理不當,而組織中p-cPLA2易失去活性,所以經反復實驗,Western blot均未檢出。

2.4 p-MEK的檢測結果

2.4.1 主動脈VSMC中p-MEK免疫組化染色結果 SHR和WKY均隨周齡增加其p-MEK表達逐漸增強,SHR表達于同周齡WKY(表2),且差異有統計學意義(P＜0.01,SHR24主動脈中各層VSMC均可見較廣泛的表達(圖4a),而WKY24表達明顯減少,且細胞著色淡,多分布于內皮下和外膜下(圖4b)。

2.4.2 p-MEK Western blot檢測結果 相對分子質量43 k D附近可見p-MEK蛋白雜交條帶(圖5),經蛋白條帶相對濃度分析顯示,隨周齡增加SHR主動脈VSMC中p-MEK蛋白相對含量逐漸增高。

表1 主動脈VSMC中p-cPLA 2的表達[個/20HPF,(%)]

表2 主動脈平滑肌細胞中p-MEK的表達[個/20HPF,(%)]

圖1 各組大鼠處死時心臟/體質量變化趨勢圖

圖2 各組大鼠血壓變化趨勢圖

圖3 主動脈VSMC中p-cPLA 2免疫組化染色(DAB顯色,×400)

圖4 主動脈VSMC中p-MEK1/2免疫組化染色(DAB顯色,×400)

圖5 主動脈VSMC中p-MEK1/2 Western blot檢測

3 討 論

高血壓時大動脈重構主要表現為管腔擴張,管壁增厚、鈣化,病變血管壁中層彈性纖維數量減少、彈性膜斷裂,膠原纖維增殖、聚集,彈力纖維與膠原纖維的比例明顯下降;彈力膜內的平滑肌細胞肥大、排列紊亂,纖維基質與平滑肌細胞的結合松散,導致大動脈順應性減退[5]。

臨床上,高血壓患者主動脈長期受高血壓及高應力的影響,順應性下降,是造成心肌肥厚和心功能不全的重要因素[1]。在高血壓患者中,約有1/3會出現左室肥厚,這是心臟對慢性壓力和容積超負荷的適應性變化,也是血管重構引起心臟受累的病理表現。本研究證實,SHR從8周齡開始血壓明顯升高,隨周齡增加,SHR血壓逐漸升高、心臟/體質量比值也逐漸升高,可能提示高血壓狀態下主動脈發生重構、順應性下降,使心臟長期壓力負荷增加而造成代償性肥厚。

磷脂酶A2是一類能水解磷脂sn-22位酯鍵釋放出游離的脂肪酸和溶血磷脂的酯酶超家族[3],分為分泌型、胞漿型和鈣離子非依賴型三大類[12],在炎癥中發揮重要作用,其中cPLA2可通過磷酸化作用而活化,活化后與細胞的增殖和凋亡有密切的關系[4]。王韻等[7]進行人臍靜脈內皮細胞內低密度脂蛋白的研究提示,cPLA2的活化參與了MM-LDL引起的AA釋放和人臍靜脈內皮細胞凋亡。Panini[8]等研究發現,cPLA2通過鈣調蛋白信號轉導途徑參與25-OHC或氧化修飾低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞和成纖維細胞凋亡。Faghini等[9]研究發現AngⅡ通過活化cPLA2后激活VSMC中Syk(一種72 k D酪氨酸激酶,與生長、分化以及造血和非造血細胞的信號轉導相關),促進VSMC分化和增殖,并由 LO促進 AA產生代謝產物。本實驗結果顯示,各周齡SHR和WKY的主動脈VSMC中p-cPLA2均有表達,且隨著大鼠周齡增加,p-cPLA2表達率增加;各周齡SHR表達均比同周齡WKY明顯減少,可能提示隨著大鼠周齡增加,內外環境的某些刺激因素可激活cPLA2,活化的cPLA2可以誘導大動脈VSMC凋亡,而在高血壓狀態下,復雜的體內外環境因素使cPLA2對大動脈VSMC凋亡調節減弱,細胞增殖活性相對增強,間質膠原纖維增殖、聚集,使大動脈重構、彈性減退、順應性下降,而促使SHR心臟肥大、心臟/體質量比值增加。

cPLA2的磷酸化激活主要是通過兩條途徑,即MAPKs信號轉導途徑和鈣/鈣調蛋白激酶信號轉導途徑,多數細胞經MAPKs信號轉導途徑中ERK通路活化cPLA2。其整個過程為:通過 Ras→Raf→MEK1/2→ERK 1/2環節中的 Raf蛋白磷酸化cPLA2的兩個 MAPKs磷酸化位點(S505和S727)而將其激活,激活cPLA2使其對細胞的分化和增殖產生調節作用[4,6]。Su等[10]研究顯示,衣原體吸收甘油磷酸變位酶必須Raf-MEK-ERK-cPLA2信號級聯的活化:Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2途徑和cPLA2可被衣原體感染活化;cPLA2抑制劑阻斷了衣原體攝取甘油磷酸變位酶并降低了衣原體的生長活性;封閉c-Raf-1或MEK 1/2的活性可以阻止衣原體ERK1/2的激活,而阻止了衣原體對宿主細胞cPLA2的活化和甘油磷酸變位酶的釋放。Pavicevic等[11]對兔VSMC進行在體研究顯示,cPLA2通過ERK 1/2途徑被絲氨酸-505(S505)磷酸化而激活。

本實驗結果顯示,各周齡SHR和WKY的主動脈VSMC中p-MEK均有表達,且隨著大鼠周齡增加,p-M EK陽性表達增加;SHR比同周齡WKY表達均明顯增高。與之相反,SHR p-cPLA2表達與同周齡WKY相比均明顯減少。提示MEK的激活與cPLA2活性減弱可能共同參與了高血壓大動脈血管重構的發生、發展。

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