IFN-γ刺激培養未成熟樹突狀細胞免疫耐受效應機制研究*

吳銀平,袁發煥,侯衛平

(第三軍醫大學新橋醫院腎病科,重慶400037)

樹突狀細胞(dendritic cells,DC)是體內最有效的抗原提呈細胞(antigen-presenting cell,APC),它不僅參與抗原的攝取及提呈,而且可誘導免疫耐受。目前研究發現DC的免疫應答還是誘導免疫耐受效應均取決于DC的成熟狀態:成熟DC表面高表達MHCⅡ類分子和共刺激分子CD80、CD86,因而可誘導CD4+Th0分化為 Th1介導細胞免疫應答;而未成熟DC(immature DC,imDC)表面低表達MHCⅡ類分子和共刺激分子CD80、CD86,可誘導CD4+Th0分化為 Th2細胞而具有誘導建立外周免疫耐受的特性[1]。Th2細胞分泌高水平的IL-4可間接促進DC的成熟,γ-干擾素(IFN-γ)則能抵抗 IL-4的效應。在外周器官組織中,DC是以一種不成熟的狀態存在,可誘導調節性T細胞(regulate T cell,Treg)產生分泌具有負調節作用的IL-10,參與外周免疫耐受的建立。Kitchen等[2]研究發現在IFN-γ基因敲除鼠可誘導更為嚴重的抗-GBM 腎炎,表現為抗原特異性T細胞的高度激活和增殖,提示由調節性T細胞分泌IFN-γ直接調控誘導免疫耐受的效應。新近研究還發現IFN-γ具有相矛盾的作用[3],既有可能引發Th1驅使的免疫應答反應,又可誘導產生調節性T細胞控制免疫反應[3],這種早期產生的IFN-γ能直接抑制具有IFNgR1和IFNgR2的T細胞,而且還可間接地預防T細胞的進一步激活。

本實驗聯合IFN-γ和imDC誘導免疫耐受特性,在體外通過IFN-γ刺激培養imDC與脾臟分離的淋巴細胞共培養,觀察淋巴細胞增殖及凋亡情況及CD4+T細胞Th1/Th2型細胞因子的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠(體質量 200～250 g)購自第三軍醫大學大坪醫院動物中心。大鼠重組IFN-γ、GM-CSF、IL-4(美國 R&D公司),熒光抗體 FITC-anti-rat MHCⅡ、FITC-anti-rat CD86、PE-anti-rat OX62、PE-anti-rat CD80 及同型對照抗體(eBioscience公司),噻唑藍(MTT,Amersha公司),RPMI-1640培養基(Hyclone公司),胎牛血清((FCS,杭州四季青公司)二甲基亞砜(DMSO,Sigma公司),IL-4、IL-13、IFN-γELISA試劑盒(美國 R&D公司),T細胞表位 pCol(28-40)多肽(上海英駿生物公司)等。

1.2 大鼠骨髓來源imDC制備 參照Son等[4]的方法,頸椎脫臼處死大鼠,70%乙醇浸泡消毒15 min。無菌取出股骨和脛骨,用鑷子固定長骨后剪刀剪去骨兩端,用RPMI-1640培養液反復沖洗出骨髓至培養皿中,直至骨變白。用200目尼龍網過濾去除小碎骨片和肌肉組織。濾液以4℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清液。Tris-NH4Cl裂解紅細胞,室溫孵育 2～3 min,4℃、1 000 r/min離心 5 min,棄上清液。洗滌 2遍后,用 24 mL DC培養液(RPMI-1640加rGM-CSF 10 ng/mL+rIL-4 5 ng/m L)重懸細胞沉淀后,接種于6孔細胞培養板中,置37℃、5%CO2細胞培養箱內孵育3 h。輕輕吸出懸浮和半貼壁細胞,4℃、1 000 r/min離心5 min棄上清液。DC培養液重懸細胞沉淀,計數并調整密度為1×106/mL,加入24孔板中培養(1 mL/孔)。置37℃、5%CO2細胞培養箱培養。每48小時新配制DC培養液半量換液,繼續培養。培養至第5天收集、計數、用滅菌PBS調整DC濃度至1×106/m L,即為imDC。

1.3 IFN-γ刺激培養的大鼠骨髓來源未成熟樹突狀細胞(im-DCIFN-γ)制備 DC取材方法同上,DC孵育3 h,轉入24孔培養板培養18 h后加IFN-γ(100 U/mL)刺激培養細胞[5],37℃,5%CO2細胞培養箱培養。每48小時新配制的DC培養液半量換液,并補充IFN-γ(50 U/mL),置37℃、5%CO2細胞培養箱培養。培養至第3天用滅菌0.01MPBS洗2次,洗去IFN-γ,調整DC濃度至1×106/m L,補充外源性抗原 T細胞表位pCol(28-40)多肽,繼續培養48 h,收集、計數、用滅菌PBS調整DC濃度至1×106/mL,即為imDCIFN-γ。

1.4 流式細胞檢測 imDC和imDCIFN-γ表型 分別收集imDC和imDCIFN-γ入刻度離心管,4℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入1 mL PBS重懸,計數,分裝入每管約1×106個細胞于EP管中。4℃、1 000 r/min離心 5 min。棄上清液,再用PBS洗3次,最后用200μL PBS重懸。然后按試劑說明書加入熒光標記抗體:PE-anti-rat CD80(1μL)、FITC-anti-ratCD86(1μL)、FITC-anti-rat MHC Ⅱ(1μL)和PE-anti-rat OX62(10 μL),4℃避光孵育30 min。Staining buffer洗滌3次,流式細胞儀檢測。

1.5 分離脾臟淋巴細胞 無菌條件下取脾組織,于200目鋼絲濾網上研磨成勻漿狀,用含2%胎牛血清的無菌生理鹽水沖入無菌平皿制成懸液,1 500 r/min離心5 min,棄上清液,加5 mL Tris-NH4Cl,靜置 2～3 min去除紅細胞,加無菌生理鹽水5～6 mL中和,1 200 r/min離心5 min,洗滌 3遍,加入大鼠淋巴細胞分離液,嚴格按說明書提取白膜層細胞。光鏡下計數后,用含10%新生牛血清的RPMI-1640調整脾細胞濃度為2×106/mL,備用。

1.6 imDC和imDCIFN-γ與脾細胞鋪板培養 實驗分組:(1)對照組,加入含血清RPMI-1640;(2)imDC組,加入培養的im-DC;(3)imDCIFN-γ組,加入imDCIFN-γ。取上述脾細胞中一部分,鋪24孔板培養,每孔0.5 mL,各孔加入制備好的imDC和im-DCIFN-γ各 0.5 mL,對照組加等量的含血清RPMI-1640,輕輕吹打混勻,置37℃,5%CO2細胞培養箱培養。每個樣本鋪6個復孔,分別于鋪板后 48、72 h收集上清液,待作相關細胞因子測試。

1.7 MTT法檢測各組與淋巴細胞的增殖情況 (1)96孔細胞培養板,每孔加入大鼠分離的脾臟淋巴細胞各100μL。(2)含血清RPMI-1640,5%CO2、37℃培養 4 h。(3)于培養細胞中加入:含血清RPMI-1640 200μL(對照組);培養的 imDC 200μL(imDC 組);imDCIFN-γ200μL(imDCIFN-γ組);均設 6 個復孔,同時設空白對照。(4)繼續培養48 h。(5)在實驗前4 h每孔加入MTT(5 mg/mL)20μL。(6)輕輕吸去上清液,每孔加入DMSO 150μL,輕輕振蕩10 min。(7)在酶標光度計上測光吸收值,測定波長為 490 nm,參考波長為630 nm,所得光吸收值代表相應孔細胞的相對數量。

1.8 流式細胞儀檢測各組淋巴細胞凋亡的情況 (1)24孔細胞培養板,每孔加入分離的大鼠脾臟淋巴細胞500μL。(2)將含血清RPMI-1640和培養細胞imDC和imDCIFN-γ加入相應的培養孔500μL,每組設6個復孔,同時設空白對照。(3)含血清RPMI-1640,37℃、5%CO2培養48 h。(4)每天各組隨機抽取2孔。分別收集各組細胞入刻度離心管,4℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清液。分裝入每管約1×106個/m L細胞于EP管中。4℃、1 000 r/min離心 5 min,棄上清液,再用 PBS洗3次。最后用200μLPBS重懸。按試劑說明書加入熒光標記抗體,PE-anti-rat CD4 mAb(10μL),4℃、30 min后洗滌3次,加PBS至500μL。按Anneix-V-Flous試劑盒說明書,用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。(5)連續檢測2 d。

1.9 Th1/Th2型細胞因子濃度測定 按照 R&D公司ELISA試劑盒說明書操作,測定脾細胞上清液中Th1型細胞因子IFN-γ(用鋪板培養后72 h收集之上清液)以及Th2型細胞因子IL-4、IL-13(用鋪板培養后48 h收集之上清液)的含量,在BIO-RAD 680酶標儀上讀取結果。

2 結 果

2.1 流式細胞儀檢測DC表型 流式細胞儀檢測(收集制備的imDC以及 imDCIFN-γ)表面 M HC Ⅱ類分子和共刺激分子CD80、CD86以及DC表面相對特異性標記OX62情況,結果發現,imDC表達的上述分子分別為20.07%、13.01%、21.38%、14.03%,均明顯低于mDC水平(mDC上述分子表達水平均在70%以上,數據未顯示)。imDCIFN-γ表達上述分子分別為14.01%、19.79%、15.31%、4.78%,均低 表達表面 MHC Ⅱ 類分子和共刺激分子 CD80、CD86;與 imDC組相比,除 CD80略高一些,其余均低于imDC組(P＜0.05,n=4),見圖1。

圖1 耐受性DC表面共刺激分子和MHCⅡ類分子的表達情況

2.2 M TT法檢測各組淋巴細胞增殖情況 對照組OD值為(0.195 0±0.016 0);imDC組為(0.197 4±0.017);imDCIFN-γ組為(0.083 6±0.012),imDC組、imDCIFN-γ組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05,n=5)。

2.3 在體外脾淋巴細胞與共培養細胞凋亡變化 采用流式細胞儀檢測各組淋巴細胞凋亡率,imDC組(1.06±0.01)與對照組(0.03±0.01)比較差異有統計學意義(P＜0.05,n=5);im-DCIFN-γ組凋亡率為(12.98±0.02),與對照組和imDC組比較均明顯增高(P＜0.05,n=5),見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測體外同等條件下大鼠脾淋巴細胞凋亡變化

圖3 脾細胞上清液中IL-4、IL-13、IFN-γ濃度

2.4 ELISA法檢測體外培養脾細胞上清液Th1/Th2型細胞因子 imDC組和imDCIFN-γ組表達 IFN-γ濃度差異無統計學意義(P＞0.05,n=5),imDC組表達IFN-γ濃度與對照組和imDCIFN-γ組比較差異有統計學意義(P＜0.05,n=5);imDCIFN-γ組表達IL-4和IL-13高于imDC組,也明顯高于對照組(P＜0.05,n=5),見圖 3。

3 討 論

DC是目前已知的機體內功能最強的“專職抗原遞呈細胞”(professional APC)[6]。DC廣泛分布于除腦以外的全身各臟器。在外周DC獲取抗原、遞呈抗原、初始化免疫反應或死亡[7-9]。DC經歷幾個不同的表型期;各個表型期DC具有不同的功能活性,不同的免疫功能。未成熟DC特點是能夠吞噬外源性抗原(通過胞吞、胞飲或各種受體介導的吞噬作用),處理并將相應的肽段結合到內源性MHC分子。由于表面表達MHC和接觸分子(CD80、CD86)的量較少,從而在抗原識別時提呈抗原而缺乏共刺激分子及細胞因子的參與介導免疫耐受。本實驗采用經典的GM-CSF+IL-4誘導方案,經IFN-γ刺激培養的imDC通過外源性抗原T細胞表位pCol(28-40)多肽培養,均低表達表面分子MHCⅡ類分子及共刺激分子CD80、CD86,同樣低表達DC表面相對特異性標記 OX62,表明經IFN-γ刺激培養的imDC對抗原的攝取和提呈能力低,未能激活T細胞免疫應答,而具有誘導免疫耐受的特性。

Wood和Bawitzki[3]研究及新近研究發現 IFN-γ誘導產生Treg控制免疫反應。Treg分泌IFN-γ對T細胞的直接調控發揮著誘導免疫耐受的效應[10]。有研究認為,Th1/Th2的動態平衡是免疫耐受的關鍵因素,IFN-γ由Th1分泌,IL-4和IL-13由Th2分泌,Th1向 Th2漂移可能是免疫耐受的形成機制[11-18]。ELISA檢測脾細胞上清液中imDC組和imDCIFN-γ組表達IFN-γ無明顯差異,但均高于對照組,同樣脾細胞上清液中imDCIFN-γ組表達IL-4和IL-13高于imDC組,且明顯高于對照組,表明IFN-γ誘導產生 Treg誘導免疫耐受的效應,并且Th1向Th2漂移,可能誘導形成免疫耐受。

imDC在經IFN-γ刺激培養后對外源性抗原的攝取和提呈能力差,能夠體外抑制T細胞增殖,促進其凋亡;同時實驗表明Th1向Th2漂移,可誘導形成免疫耐受。該實驗的結果有待于體內實驗進一步驗證,這將為臨床進一步研究免疫耐受提供新的思路。

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