45例腎病綜合征患者腎組織c-Jun和c-Fos的表達及意義

喬 麗,余月明,曹禮應,蔡純青,郭 虹,王柏青,吳永雪

(成都軍區昆明總醫院腎臟科 650032)

原發性腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是一種免疫炎癥性疾病,臨床上以糖皮質激素(glucocorticoid,GC)治療為主,但患者對激素的反應不同。部分患者開始對GC敏感,在GC減量維持過程中因感染等原因,蛋白尿再次出現,并出現GC抵抗,其機制尚不清楚。GC要與糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GR)結合后才能發揮作用。活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)是一類在細胞中發揮重要作用的核轉錄因子,介導許多與免疫反應有關的細胞因子基因的轉錄活化過程,促進炎癥的發生。AP-1的組成成員主要包括c-Jun和c-Fos。近年來的研究證實,AP-1和GR相互拮抗,AP-1的變化影響GR的活性。因此c-Jun和c-Fos的含量可影響機體對GC的反應。為此,本研究選取45例原發性NS患者檢測腎臟組織中c-Jun和c-Fos表達水平,探討這兩種轉錄因子在激素抵抗型NS患者中的作用及其臨床意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 入選病例為2006年1月至2006年5月在第三軍醫大學附屬新橋醫院腎內科的原發性NS患者,腎活檢為微小病變或輕度系膜增生性腎小球腎炎患者。均符合1992年中華腎臟病學會制定的原發性腎小球疾病分類標準。各種繼發性腎小球腎炎患者、合并其他器官慢性炎癥(如:肝硬化、支氣管哮喘、動脈粥樣硬化等)患者不進入本實驗。

1.2 實驗分組 根據GC效果將原發性NS患者分為3個組:激素抵抗組,指潑尼松足量(1mg?kg-1?d-1)治療12周后,尿蛋白仍無明顯減少者,15例,其中男13例,女2例,年齡14～60歲;激素敏感組,指潑尼松足量治療8周內尿蛋白轉陰的患者,減量后尿蛋白仍然陰性,15例,其中男9例,女6例,年齡18～59歲;復發后抵抗組,指潑尼松足量治療8周內尿蛋白轉陰,在激素減量過程中于數周或數月后尿蛋白再次出現而再入院,增加激素用量仍不敏感的患者,15例,其中男13例,女2例,年齡14～60歲。

1.3 檢測方法

1.3.1 標本的收集 45例患者均于治療前行腎活檢術。其他指標按常規方法收集標本。

1.3.2 c-Jun和c-Fos免疫組織化學檢測 采用SP法進行(試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司,兔抗人c-Jun和c-Fos多克隆抗體分別購自Santa Cruz公司和福建邁新公司)。所用玻片經多聚賴氨酸預處理。將腎活檢組織常規石蠟包埋、切片(3μm)、脫蠟、脫水、微波修復、過氧化氫阻斷、山羊血清封閉、加兔抗人c-Jun(1∶50)或c-Fos抗體(工作原液)、4℃過夜、PBS沖洗后,滴加生物素標記的羊抗兔二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素,于37℃分別孵育20min,DAB顯色,蘇木素復染,封片。陰性對照采用PBS代替一抗。

1.3.3 圖像分析 對免疫組織化學檢測結果進行顯微數碼攝影,注意攝影參數及輸入圖像背景灰度值一致。用Qwin圖像分析軟度件(leica)分析照片中腎臟組織的染色情況,所測定的腎臟組織灰度值表示腎臟組織的免疫組織化學染色強度。該軟件平均灰值越高則切片上免疫組織化學陽性反應呈現的顏色越淺,平均灰度值越低表明切片上免疫組織化學陽性反應呈現的顏色越深。

表1 各組患者血液生化和血白細胞檢測結果比較(±s)

表1 各組患者血液生化和血白細胞檢測結果比較(±s)

組別n肌酐(μmol/L)白蛋白(g/L)24h尿蛋白(g/d)白細胞(×109/L)激素敏感組15 71.27±6.08 20.17±3.57 3.83±0.28 8.18±1.74激素抵抗組15 82.50±17.39 19.91±3.95 3.86±0.27 9.01±1.33復發后抵抗組15 72.07±24.23 20.28±5.49 3.91±0.29 9.84±3.36

2 結 果

2.1 臨床指標 各組間年齡、性別差異無統計學意義(P＞0.05);各組間腎功能、血漿白蛋白、血白細胞和24h尿蛋白定量差異亦無統計學意義(P＞0.05),見表1。

圖1 c-Jun在激素敏感組中的表達(×400)

圖2 c-Jun在激素抵抗組中的表達(×400)

圖3 c-Jun在復發抵抗組中的表達(×400)

圖4 c-Fos在激素敏感組中的表達(×400)

圖5 c-Fos在激素抵抗組中的表達(×400)

圖6 c-Fos在復發抵抗組中的表達(×400)

表2 各組C-jun和C-fos表達強度(灰度值)的比較(±s)

表2 各組C-jun和C-fos表達強度(灰度值)的比較(±s)

組別n c-Jun c-Fos激素敏感組15 183.07±4.28 180.13±7.21激素抵抗組15 160.27±6.62 162.24±7.31復發后抵抗組15 158.90±5.66 162.96±8.97

2.2 c-Jun和c-Fos的表達 c-Jun和c-Fos在各組患者的腎小球和腎小管的胞核內均有表達,呈強弱不等的棕黃色(圖1～6)。復發后抵抗組和激素抵抗組腎組織中c-Jun和c-Fos表達明顯高于激素敏感組(P＜0.05);復發后抵抗組與激素抵抗組之間c-Jun和c-Fos表達差異無統計學意義(P＞0.05),見表2。

3 討 論

GC與GR結合是GC發揮抗炎和免疫抑制作用的前提條件,說明GR在調節GC療效方面具有極其重要的功能。GR作為一種轉錄因子,當與胞漿中的GC結合后,形成GC-GR復和物迅速轉移進細胞核與糖皮質激素反應元件(glucocorticoid response element,GRE)結合調控靶基因轉錄,從而發揮GC的作用[1]。AP-1是一類在細胞中發揮重要作用的核轉錄因子,其組成成員主要包括c-Jun和c-Fos家族。AP-1能與DNA結合,并可與其他的轉錄因子家族以及細胞核激素受體結合。生理情況下,AP-1分子的構成以c-Jun同源二聚體為主,具有微弱的DNA結合和基因轉錄活性。當細胞受到刺激(如生長因子、細胞因子、神經介質和細胞外應激等)時,AP-1迅速轉變為以c-Jun和c-Fos異源二聚體為主的形式,其與DNA結合位點的結合能力及促進基因轉錄的活性顯著增強,從而促進炎癥反應的發生[2]。AP-1能干擾GC-GR復合體與GRE結合,降低GC生物學作用[3]。

本研究發現,各組原發性NS患者腎小球和腎小管的胞核內c-Jun與c-Fos均有表達,激素抵抗組和復發后抵抗組腎組織中c-Jun與c-Fos的表達均高于激素敏感組。提示激素抵抗型NS患者腎臟組織中過表達的c-Jun和c-Fos可能影響GR功能,影響GC效應的發揮,從而導致激素抵抗。同時也提示了c-Jun和c-Fos含量越高對激素的療效越差,越低療效越敏感。究竟是c-Jun還是c-Fos影響了GR,目前說法并不一致。有許多實驗證實了c-Fos的增加會影響GR的水平,Lane等[4]檢測了激素抵抗型哮喘患者外周血單核細胞c-Fos的mRNA水平及蛋白含量,發現激素抵抗組核酸及蛋白水平均高于正常對照組和激素敏感組,但在地塞米松孵育的外周血單核細胞中加入c-Fos的反義寡核苷酸后,GR與GRE的結合明顯增加。但是也有實驗證實c-Jun也會影響GR,程曉剛等[5]研究表明c-Jun蛋白表達水平對GR的表達和轉錄激活活性有影響,抑制c-Jun蛋白表達,一定程度上可促進GR表達并增強其轉錄激活功能。而本研究發現在激素抵抗時c-Jun與c-Fos都升高。

激素抵抗的機制現在仍不清楚,作者前期的實驗研究發現激素抵抗組和復發后抵抗組患者血清中IL-1β和TNF-α明顯高于激素敏感組[6]。已有的研究發現,IL-1β、TNF-α可使AP-1的活性升高,是否IL-1β和TNF-α通過影響AP-1活性繼而影響糖皮質激素受體活性而發生激素抵抗,還有待進一步研究。但是本試驗說明AP-1的高表達可能在激素抵抗的發生機制中起重要作用,與文獻報道相符[7-9]。但是AP-1的高表達是通過干擾GC-GR與GRE結合而導致激素抵抗,還是直接與GR結合使GR減少而導致激素抵抗,還需進一步研究。

總之,腎組織中c-Jun和c-Fos的表達變化與原發性NS患者激素抵抗密切相關;檢測腎組織中c-Jun和c-Fos的表達,有助于原發性NS患者預后判斷和指導治療方案的調整。

[1]Horwitz KB,Jackson TA,Bain DL,et al.Nuclear receptor coactivtor and corepressor[J].Mol Endocrinol,1996,10(10):1167.

[2]Jennifer R,Timoshanko A,Richard K,et al.Leukocytederived interleukin-1βinteracts with renal interleukin-1 receptor I to promote renal tumor necrosis factor and glomerular injury in murine crescentic glomerulonephritis[J].AM J Pathol,2004,164(6):1967.

[3]Martens C,Bilodeu S,Maira M,et al.Protein-protein interactions and transcriptional antagonism between the subfamily of NGFI-B/Nur77 orphan nuclear receptors and glucocorticoid receptor[J].Mol Endocrinol,2005,19(4):885.

[4]Lane SJ,Adcock IM,Richards D,et al.Corticosteroid-resistant bronchial asthma is associated with increased c-fos expression in monocytes and T lymphocytes[J].J Clin Invest,1998,102(12):2156.

[5]程曉剛,粟永萍,羅成基,等.C-Jun蛋白對糖皮質激素受體表達及轉錄激活能力的影響[J].免疫學雜志,2005,21(3):107.

[6]喬麗,張耀全,袁發煥,等.激素抵抗腎病綜合征患者血清IL-1β和TNF-α的變化及意義[J].重慶醫學,2006,35(23):2148.

[7]Bladh LG,Lidén J,Dahlman-Wright K,et al.Identification of endogenous glucocorticoid repressed genes differentially regulated by a glucocorticoid receptor mutant able to separate between nuclear factor-kappaBand activator protein-1 repression[J].Mol Pharmacol,2005,67(3):815.

[8]Adeoek IM,Lane SJ,Brown CR,et al.glucocorticoid receptor-activator protein 1 interaction in steroid-resistant asthma[J].Exp Med,1995,182(6):1951.

[9]Cabral A L,Hays AN,Housley PR,et al.Repression of glucocorticoid receptor gene transcription by c-Jun[J].Mol Cell Endocrinol,2001,175(122):67279.