養(yǎng)殖黑鯛遲緩愛德華菌的分離鑒定

閆茂倉 王雪鵬 丁 雷（浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 溫州 325005 山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院）

遲緩愛德華菌是革蘭氏陰性、能運動的短桿菌(直徑1μm，長2～3μm)，可在NaCL濃度0～40g/L的培養(yǎng)基上生長，菌落直徑0.5～1.0mm，菌落圓形，邊緣整齊，灰白色，濕潤。4～10℃能夠生長，最適生長溫度25～32℃，可在SS瓊脂培養(yǎng)基上生長，菌落為黑色。這一種屬的細菌主要是從人類的糞便、血液、傷口和尿中分離出來，因為這些細菌在生物學上與其他腸桿菌科成員不同，所以在1965年以美國細菌學家愛德華(1901～1966)的名字重新命名，為遲緩愛德華菌[1,2]。

遲緩愛德華菌由Hoshina在1962年首次從鰻鱺中分離到，感染范圍很廣，主要包括大菱鲆，牙鲆，鰻魚，胭脂魚，大馬哈魚，鱒魚，鯉魚，羅非魚，鯰魚和鱔魚等，還可以感染兩棲類、爬行類、鳥類、哺乳類等動物（包括人），是一種人畜共患病。不僅宿主種類不斷增多，地域范圍也不斷擴展，除中國、日本、韓國、新加坡外，在美國、德國、意大利、南非、和挪威等都有相關(guān)病例報道[1,2]。

2009年夏季，浙江沿海某養(yǎng)殖場的黑鯛成魚發(fā)生大規(guī)模死亡，作者從中分離了一株優(yōu)勢菌，經(jīng)感染證實了該株菌是引起此次病害的病原菌，根據(jù)其形態(tài)學特性、培養(yǎng)特性、生化特性等，鑒定為遲緩愛德華菌，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 患出血病癥狀典型的瀕死黑鯛。

1.1.2 培養(yǎng)基 2216E、TSB瓊脂、LB培養(yǎng)基、 SS培養(yǎng)基，購自北京路橋技術(shù)有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng) 取患出血病癥狀典型的瀕死黑鯛，用70%酒精棉球?qū)Σ◆~體表消毒后，用無菌剪刀剪開腹腔并取出病魚肝、腎、脾等組織小塊于1ml無菌離心管中，在超凈工作臺上用無菌蒸餾水反復(fù)沖洗組織塊，劃線接種于2216E、TSB瓊脂、LB培養(yǎng)基、 SS培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24～48h，進行細菌形態(tài)特征觀察。

1.2.2 細菌形態(tài)學觀察 取純培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色，顯微鏡觀察；同時送到電鏡室做掃描電鏡觀察。

1.2.3 細菌生化試驗 將菌種接種于TSA平板，28℃培養(yǎng)過夜。將細菌送至南京進出口檢驗檢疫局用自動生化分析儀進行生化特性測定。

1.2.4 人工感染試驗 感染用魚210±10g，水溫為23～27℃，試驗容器為200L的水槽。先將分離菌接種在TSB固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)36h,用滅菌的生理鹽水洗下菌落，調(diào)整菌液濃度為1×108。10倍系列稀釋共5個組，每組5尾，每尾腹腔注射100μl，對照組注射等量生理鹽水，觀察其感染后的發(fā)病與死亡情況，計算7d內(nèi)的半數(shù)致死量。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特征

從患病黑鯛分離到一株優(yōu)勢菌，此菌在2216E瓊脂平板上生長緩慢，28℃恒溫培養(yǎng)48h后形成白色細小菌落，直徑小于0.5mm。在TSB和LB培養(yǎng)基上37 ℃生長36 h后形成圓形菌落，直徑約0.5mm，微黃色，不透明；在TCBS平板上難以生長；在SS培養(yǎng)基上形成黑色菌落(見圖1)。

圖1 遲緩愛德華菌在SS培養(yǎng)基上生長的照片

2.2 形態(tài)特征

分離菌在顯微鏡和電鏡下的照片見圖2，革蘭氏陰性，呈短桿狀。

圖2 遲緩愛德華菌革蘭氏染色照片（A）和電鏡照片（B）

表1 分離菌的生化試驗結(jié)果

2.4 感染試驗

在1周內(nèi)，各感染組陸續(xù)出現(xiàn)死亡，對照組未出現(xiàn)癥狀，感染后的病魚體表變黑，吻端發(fā)紅，腹部鼓起有腹水，肛門紅腫或突出體外。解剖后肝臟有的為白色斑點，脾臟腫大，腎臟暗黑色，易碎成糜狀；腸黏膜充血，腫脹。經(jīng)計算半數(shù)致死量為8.31×104cfu/mL，表明此菌有很強的致病性。

3 討論

遲緩愛德華菌由日本學者于1962年在鰻鱺養(yǎng)殖場發(fā)病的鰻魚中首次分離得到[3]。它可引起多種海、淡水魚類的疾病，并且屬于人畜共患的病原，因此對該菌的研究具有重要意義。本文從患病黑鯛體內(nèi)分離出一株優(yōu)勢菌，經(jīng)感染試驗證明其為強毒株，在較低的劑量下也可引起黑鯛死亡。利用生化實驗可準確鑒定為遲緩愛德華菌，可信度為99%。綜合形態(tài)學特性、培養(yǎng)特性、生化特性、回歸試驗等可鑒定為遲緩愛德華菌感染。

近幾十年來，我國對遲緩愛德華菌的研究較多，而有關(guān)遲緩愛德華菌感染黑鯛的研究比較少。最近有很多遲緩愛德華菌感染大菱鲆、牙鲆等魚的報道[4]，且感染率和死亡率都很高，遲緩愛德華菌病應(yīng)當引起足夠的重視。

[1]Mohanty BR, Sahoo PK. Edwardsiellosis in fish: a brief review. J Biosci 2007;32(7):1331–1344.

[2]Xuepeng Wang, Chengping Lu. Mice orally vaccinated with Edwardsiella tarda ghosts are significantly protected against infection.Vaccine 2009, 27 :1571-1578.

[3]Hoshina T. On a new bacterium, Paracolobactrum anguillimortiferum.Bull Jpn Soc Sci Fish 1962,28(2):162–164.

[4]楊春志,王秀華,黃倢.養(yǎng)殖大菱鲆遲緩愛德華氏菌的分離鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].上海水產(chǎn)大學學報,2008,17(3):280-284.