二株禽支原體的分離與鑒定

劉 玲 管鳳霞 黎 敏 宋永峰 高 恒 梁思陽 溫納相（廣東溫氏食品集團有限公司 新興 527400）

雞支原體屬原核生物，無細胞壁，由細胞膜包裹［1］。迄今為止確認對雞致病的支原體有4 種, 包括引起雞慢性呼吸道病和火雞傳染性竇炎的禽雞毒支原體(MG)，引起雞和火雞亞臨床或臨床感染的滑液囊支原體(MS)，引起火雞氣囊炎的火雞支原體和衣阿華支原體(MI)［2］。

MG可引起家禽慢性呼吸道病(CRD)，本病流行于世界各國，是當前冬春季節影響禽類生產的常見疾病之一。其特征性的癥狀是呼吸啰音、咳嗽、氣管炎、氣囊炎、流眼淚等。MG除引起呼吸道疾病癥狀外，還導致雛雞成活率低，生長遲緩，增重減慢，飼料轉換率降低，肉雞屠宰率降低；MS感染主要引起家禽的滑膜炎、呼吸道癥狀,臨床表現為：冠蒼白、跛行、關節腫脹、輕度啰音、生長遲緩、產蛋下降等［1］。

本研究從廣東某雞場送檢的疑似支原體感染病料中分離、培養獲得了2株支原體，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來自廣東新興某雞場的病雞，無菌取病雞下支氣管三叉部、肺臟等。

1.1.2 試劑 改良的 Frey 氏培養基購自北京鼎國生物技術有限公司、支原體標準菌株、抗原、陽性血清，均購自中國獸藥監察所。DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，Ex-Taq酶購于大連寶生物工程公司。

1.1.3 儀器設備 生化培養箱、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、蒸汽滅菌器、PCR儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 支原體的初步分離 無菌操作：將下支氣管三叉部、氣囊、肺等部位的組織，分別用2000IU/ml的青霉素漂洗3遍并剪碎成芝麻粒大小后，各種組織分別挑選3塊加入裝有1.8ml液體培養基的西林瓶中，蓋好膠塞。置37℃生化培養箱中培養，每天觀察液體培養基顏色變化和混濁度，有雜菌生長者棄之。每隔3d盲傳一代，要求至少傳三代，有顏色變化，注意及時調節pH值；若無顏色變化，繼續觀察15d后棄之。

1.2.2 分離物的純化 將變色后的液體培養基接種到固體培養基中，于37℃培養8d，待菌落生長后挑選單個菌落再接種到液體培養基中，連續重復3次，以取得純培養物。

1.2.3 分離物的形態觀察 取純培養物涂于載玻片上，姬姆薩染色，顯微鏡下觀察菌體形態。

1.2.4 血清學診斷 平板凝集試驗(SPA):取10ml純培養物以4000rpm 離心30min，棄上清，用0.5ml生理鹽水重懸菌體，作為抗原液。滴3滴抗原于載玻片上，每滴抗原依次加入等量的生理鹽水、標準MG抗血清、標準MS抗血清，充分混勻后，3min內判定結果，液滴中出現明顯的粗大顆粒者為陽性。并同時設標準的MG、MS陽性對照。

1.2.5 分子生物學 根據GenBank上公布的MG、MS序列，設計套式PCR引物見表1，并由上海英駿生物技術有限公司合成。套式PCR引物設計選取的基因片段及目標片段大小見表2。取純培養物，提取DNA進行套式PCR擴增，凝膠電泳觀察結果。

表1 PCR引物

表2 PCR目標片段

2 結果

2.1 初次分離及純化結果

初次分離，2個樣品接種于液體培養基中培養3d。培養基顏色變黃，盲傳及純化后，接固體平皿上增殖至第7天，在倒置顯微鏡下看到典型的“煎蛋”樣，具有一個致密中心的突起菌落(見圖1)。

圖1 支原體固體平板上的“煎蛋”樣菌×80

2.2 姬姆薩染色結果

姬姆薩染色后光鏡下可見菌體大多呈球點狀或鏈球狀，菌體被染成紫色，說明分離到2株支原體，分別命名為GX1和GX2。

2.3 血清學結果

在血清平板凝集試驗中，MG抗血清能使分離株GX1發生凝集，MS抗血清能使分離株GX2發生凝集，2min內形成明顯的粗大顆粒。平板凝集結果見表3，初步說明GX1株是MG，GX2株是MS。

2.4 套式PCR結果

將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，結果顯示：GX1株可以擴增出約408bp的目的片段，即MG陽性，；GX2株可以擴增出688bp的目的片段，即MS陽性（見圖2）。

表3 血清學結果

圖2 MG MS擴增結果

3 討論

此試驗成功在本實驗室建立支原體分離培養鑒定的方法，并根據培養特性觀察、血清學試驗、分子生物學試驗結果判定從病料分離到2 株支原體分離物，一株為雞毒支原體，另一株為滑液囊支原體，為以后開展該病的研究奠定了基礎。

由于支原體既可通過水平傳播，又可經卵垂直傳播，從而導致雞群發生感染時很難將其徹底清除。目前檢測方法主要有分離培養法、電鏡法、血清學方法以及分子生物學方法[3]，血清學方法由于常出現非特異性的交叉反應而影響診斷的準確性[4]，而分離培養由于支原體對所需條件要求苛刻，培養時間長，操作繁雜，不適應現代集約化養禽業發展的需要[1]。PCR 法方法簡單快速，敏感性遠高于前兩種方法，可應用于該病的早期診斷和檢疫，但技術條件要求較高，在檢測時常由于抑制劑的干擾等因素而可能出現假陽性反應[5]，因此最終確診需要多種檢測方法聯合使用。

支原體所需培養條件高，生長緩慢，不易分離得到。結合本次試驗，對該技術的幾個關鍵點進行總結。據文獻[6]報道新鮮支氣管和肺組織中因雜菌污染少容易分離出雞毒支原體, 因此本試驗取與肺相連的三叉氣管剪碎成芝麻粒放入改良的Frey氏培養基培養，分離率明顯較其它器官提高。培養過程中，液體培養基顏色變黃時調pH值一般直接滴加20%氫氧化鈉，但這樣對處于生長期的病原應激較大，建議滴加pH值10～12的培養基進行調節。因致病性支原體在固體培養基上培養需3～10d才能形成菌落，而無致病性支原體，如雞支原體、家禽支原體1d內就可能形成菌落，因此，2d內形成的菌落，均可判為污染物棄之。醋酸鉈抑制真菌生長，在分離培養過程中發揮著關鍵性作用，由于支原體生長速度較慢，為防止初次分離時其它雜菌生長消耗大部分營養，影響支原體的正常增殖，所以初次分離培養時，醋酸鉈、青霉素必須用量加倍。

[1]Yoder, H. W., Jr. Mycoplasma gallisepticum infection. In：Disease of Poultry, 9 th ed. B. W. Calnek, H. J. Barnes, C. W. Beard, R. W. Reid and H. W. Yoder, Jr., eds. Iowa State University Press, Ames, Iowa. In press.1991.212-231.

[2]邵國清. 我國主要動物支原體病研究述略與展望[J].畜牧與獸醫,2000, 32 (2) : 37-38.

[3] 段艷華,劉暢,宋海濤等.雞毒支原體的診斷與防治[J].上海畜牧獸醫通訊,2007,2:60-61.

[4]陳鳳梅,牛鐘相,程光民等. 雞毒支原體研究進展[J].動物醫學進展,2004 , 25 (3) :56-59.

[5]劉利明,馮立志,胡登峰等. 雞毒支原體研究進展[J].中國畜牧獸醫,2005 , 32 (6) :61-62.

[6]林居純，曾振靈，向榮等.雞毒支原體的分離鑒定[J].養禽與禽病防,2007,8:21-22.