東北酸菜發酵中幾株乳酸菌的篩選

李嘉祺,趙文婧,張 茜,段學強,單樹花

(太原師范學院生物系,山西太原 030031)

東北酸菜發酵中幾株乳酸菌的篩選

李嘉祺,趙文婧＊,張 茜,段學強,單樹花

(太原師范學院生物系,山西太原 030031)

從東北酸菜汁液出發,有目的地篩選到3株菌株,通過對其形態特征、菌落特征及生化特征進行分析可知,3株菌株均為乳桿菌屬。對篩選到的乳桿菌屬進行酸菜發酵性能研究發現,其中菌株L2在發酵24 h后,產酸量達到2.5%,酸度達到1.73 g乳酸/100 mL,且發酵無異味,口味自然,效果較好。

乳酸菌;酸菜;選育

我國利用乳酸菌進行發酵,加工、貯存蔬菜的方式已有幾千年的歷史了[1],并在全世界許多國家和地區廣為流傳。其方法簡便、易掌握,且能進一步改善蔬菜風味、增進食欲[2]。我國蔬菜資源豐富,酸菜作為我國東北地區一種傳統的乳酸發酵蔬菜制品,口感清爽,營養豐富,風味獨特[3],其汁液中富含乳酸菌活菌,賦予酸菜多種營養保健功效[4]。酸泡菜是世界性大眾化蔬菜發酵制品,其主要發酵菌群是乳酸菌。目前對西式泡菜、朝鮮泡菜、四川泡菜發酵過程中微生物區系已有較多研究,但對于酸菜這一中國東北地區特有發酵制品的微生物學研究及接種后發酵過程中乳酸菌種類的變化,國內的報道還很有限。本研究旨在對傳統自然發酵的酸菜進行乳酸菌的分離鑒定,為酸菜的純菌發酵和現代工業化生產奠定基礎[5-8],進而探索出接種微生物純培養物促進蔬菜發酵的新方法用于工業生產[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 酸菜(東北特產)。

1.1.2 試劑 酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、溴甲基酚紫、磷酸氫二鉀、醋酸鈉、檸檬酸銨、硫酸鎂、Tween-80、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈣、過氧化氫,均為分析純。

1.1.3 儀器 生化培養箱、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋。

1.1.4 培養基 ①初篩平板培養基:牛肉膏1%,酵母膏0.5%,蛋白胨1%,葡萄糖5%,瓊脂1.5%,溴甲基酚紫0.04%,磷酸氫二鉀0.2%,醋酸鈉0.5%,檸檬酸銨0.2%,硫酸鎂0.02%,Tween-800.1%,pH 6.6,121℃滅菌20 min;②復篩試管培養基:同初篩平板培養基,121℃滅菌20 min;③產乳酸鑒定[5]:通過紙層析乳酸定性試驗確定出產乳酸細菌。紙層析法:濾紙,溶液系統為正丁醇∶甲酸∶水=10∶2∶15,顯色劑為0.04%溴酚乙醇溶液,0.1 mol/L NaOH調pH至6.7,乳酸標準溶液濃度為2%,標準液、各菌株發酵液以毛細管點樣,上行層析,顯色比較各斑點的Rf值;④生理生化特性鑒定[8]:a.生化特性研究(接觸酶反應):將待鑒定菌種接種于乳酸菌培養基斜面上,37℃培養20 h后,在斜面上取1環接種菌苔于載玻片,然后滴加1滴過氧化氫溶液,觀察有無氣泡產生;b.生理特性研究(生長曲線的繪制):將分離出的菌株接到液體種子培養基中,每隔4 h吸取菌液,以培養時間為橫坐標,菌落總數的對數為縱坐標,繪制生長曲線。斜面培養基:葡萄糖2%的MRS固體培養基,121℃滅菌20 min;④液體種子培養基:葡萄糖5%MRS液體培養基,121℃滅菌20 min;⑤平板計數培養基:葡萄糖5%MRS固體培養基,121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離篩選[10]①初篩:取外觀無污染,味道純正的自然發酵酸菜液為分離樣,采用10倍梯度稀釋法,選擇適宜的稀釋度,涂布在乳酸菌初篩平板上,37℃下培養48 h,挑取溶CaCO3圈較大、培養基變黃的菌落;②復篩:將初篩得到的菌株用接種針轉接到復篩試管斜面培養基上,37℃下培養36 h,再挑選試管內斜面培養基顏色變化較大的菌株,接到平板培養基上純化、分離出單菌落。

1.2.2 乳酸菌鑒定方法 ①形態特征鑒定[11]: a.菌落形態:觀察平板培養基上菌落形態,分離單菌落并記錄結果;b.菌株革蘭染色:將所分離的單菌落進行革蘭染色,于100倍油鏡下觀察;c.菌落數的檢測:采用菌落平板計數法測定;②產酸量測定:采用0.1 mol/L的NaOH堿液滴定法,以酚酞為指示劑,分析結果以乳酸計。

2 結 果

2.1 菌種的初篩結果

以在初篩平板培養基上單菌落黃色菌圈大小進行篩分,挑得120株菌。

2.2 菌種的復篩結果

取0.9 cm×9 cm試管,向其中注入3.0 mL的復篩試管培養基,擺斜面后轉接菌種,挑選試管內培養基顏色變化較大的菌株,轉接到平板培養基上純化、分離單菌落,劃平板純化、分離,得到3株,編號分別為L1、L2、L3。

2.3 菌種的鑒定結果

根據菌種形態培養特征和革蘭染色、乳酸層析、接觸酶反應,目的菌株L1、L2、L3均為乳桿菌,鑒定結果如下。

2.3.1 形態鑒定結果 菌種的形態特征是鑒別菌種的重要特征參考,乳酸菌多為桿菌和球菌,革蘭染色多為陽性,但有些菌株培養時間過長會變為陰性。所篩選的產酸較高的3株菌37℃下,在分離培養基上培養48 h的菌落和鏡檢形態特征見表1、表2。

表1 菌株在分離培養基上的菌落形態Table 1 Morphological characteristics of strains

表2 菌株鏡檢形態特征及生化特性比較Table 2 Comparasion of morphological characteristics and biochemical characteristics

2.3.2 乳酸菌的鑒定結果 ①產酸量的測定:由表3結果可知,各菌株的溶CaCO3圈的大小與產酸量的多少呈正相關;在篩選的3株菌株中以L2的溶CaCO3圈最大,產酸量也最多,達2.5%,其次為L3,產酸量為2.3%,再次為L1,產酸量為2.1%。其他菌株溶CaCO3圈均不如此3株菌株,因此,L1、L2、L3作為優選出的3個高產酸菌株;②紙層析乳酸定性結果:采用乳酸定性分析,通過紙層析法對乳酸標準溶液和L1、L2、L33株菌株的發酵液進行對比試驗,結果表明,L2、L3和L1的發酵液中均含有乳酸,說明此3株菌株為產乳酸菌株。

表3 標準乳酸與幾株菌株發酵液紙層析的Rf值比較及產酸量Table 3 Comparasion of Rf value and acid production

2.3.3 生理生化特性鑒定結果 ①生化特性鑒定結果:接觸酶反應:過氧化氫酶能催化過氧化氫分解成氧和水,大多數乳酸菌觸酶反應陰性,故此項測定是乳酸細菌鑒定的一個重要的依據,反應結果見表2、表4;②生理鑒定結果:L2、L3、L1菌株生長曲線見圖1,發酵過程酸度變化曲線見圖2。

圖1 L2、L3、L1菌株生長曲線Fig.1 Growth curves ofL2、L3、L1 strains

表4 L1、L2、L3的生化鑒定結果Table 4 Physiological and biochemical experiment ofL1、L2、L3

由圖1可見,L1菌株在培養4 h后即進入對數生長期,20 h進入穩定期,L2和L3菌株具有類似的生長曲線,32～48 h進入穩定期。從3菌株的比較看,生長的前期以L1為主,后期以L2和L3為主。

圖2 發酵過程酸度變化曲線Fig.2 Fermentative process acidity change curve

3 討 論

本實驗從酸菜汁中分離出3株典型的產乳酸的菌株,經紙層析法測定所產酸為乳酸,經形態特征、菌落特征和生理生化特征鑒定均為乳桿菌屬; 3株菌在酸菜發酵過程中都表現出快速產酸、高發酵性能和良好的酸菜發酵環境適應能力。其中菌株L2在發酵24 h后,產酸量達到2.5%,酸度達到1.53 g乳酸/100 mL,可知L2為酸菜發酵高產酸菌株,在大規模工業生產時可以對L2菌株擴大培養,從而大大提高工業生產的效率。

[1]鐘之絢,郭劍.酸白菜發酵中乳酸菌群的分析[J].微生物學報,1995,31(1):74-76.

[2]任濤,于英.微生物對蔬菜研制品風味及品質的影響[J].中國調味品,1989,(7):5-8.

[3]侯紅漫,宋海波,劉揚,等.酸菜汁中乳酸菌的分布[J].食品科學,1997,18(1):29-32.

[4]楊沽彬,郭興華,張篪,等.乳酸菌:生物學基礎及應用[M].北京:中國輕工業出版社,1996.

[5]陳曉平,劉華英.自然發酵酸菜汁中乳酸菌的分離篩選與鑒定研究[J].食品科學,2006,27(2):91-94.

[6]閔華,袁林峰.發酵蔬菜乳酸菌的分離及培養基的篩選[J].江西農業學報,2002,14(2):62-64.

[7]沈國華,盧英.優良乳酸發酵菌種特性的研究及菌種篩選[J].中國調味品,2002,(3):22-25,35.

[8]凌代之,東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業出版社.1999.

[9]羅斯A H(朱慶裴等譯).發酵食品[M].北京:輕工業出版社,1989:10.

[10]熊濤,徐立榮,范鐳,等.蔬菜發酵專用乳酸菌的選育[J].食品科學,2008,29(6):264-267.

[11]布坎南R.E,吉本斯R.E.,等.伯杰細菌鑒定手冊(第8版) [M].北京:科學出版社,1984.

Screening of Some Lacto-Bacteria Strains from Sauerkraut Fermentation in NE China

LI Jia-qi,ZHAO Wen-jing,ZHANG Xi,DUAN Xue-qiang,SHAN Shu-hua
(Taiyuan Normal Uni.,Shanxi030031)

Three strains were screened intentionally starting from sauerkraut juice collected from NE China.It was known through analyses of their morphological,colony,and biochemistry features they all belonged to the genus of Lactobacillus.It was found after studying on 24 h after cabbage sauerkraut fer mentation that strain L2 produced acid as high as 2.5%,with the acidity at 1.73 g lactic acid/100 mL,and the fer mentation did not produced strange odor, the sauerkraut tasted natural and produced fine result.

lacto-bacteria;sauerkraut;breeding

Q93-331

A

1005-7021(2010)06-0068-03

太原師范學院2009年大學生科技創新項目

李嘉祺 女,生物技術專業。研究方向為微生物學。E-mail:lijiaqi1861@163.com

＊通訊作者。E-mail:maomaozx@126.com

2010-09-07;

2010-11-05