EBV轉(zhuǎn)化的人乳頭瘤病毒感染者B淋巴母細(xì)胞系的建立及應(yīng)用

王雪蓮,王佐周,安春麗,宋 陽

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,遼寧沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,遼寧沈陽 110001; 3.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實驗中心,遼寧沈陽 110001)

EBV轉(zhuǎn)化的人乳頭瘤病毒感染者B淋巴母細(xì)胞系的建立及應(yīng)用

王雪蓮1,王佐周2,安春麗1,宋 陽3＊

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,遼寧沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,遼寧沈陽 110001; 3.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實驗中心,遼寧沈陽 110001)

建立EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞系(LCL),應(yīng)用此細(xì)胞系作為抗原遞呈細(xì)胞篩選抗原特異性的T細(xì)胞克隆。收集人乳頭瘤病毒(HPV)感染者外周血20份,分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC),利用Pan T細(xì)胞試劑盒去除PBMC中的T細(xì)胞,獲得non-T淋巴細(xì)胞,EBV病毒轉(zhuǎn)化non-T淋巴細(xì)胞。應(yīng)用轉(zhuǎn)化的LCL細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞,EL ISPOT篩選可能的HPV抗原特異性的T細(xì)胞克隆。成功建立18個LCLs,建株成功率為90%。轉(zhuǎn)化成功的LCL細(xì)胞體積增大,聚集成團(tuán)狀或簇狀。建株失敗的兩份標(biāo)本,用于轉(zhuǎn)化的non-T淋巴細(xì)胞數(shù)少于2×106。應(yīng)用LCL細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞篩選出64個HPV抗原特異性的T細(xì)胞克隆。成功建立LCLs,此細(xì)胞系細(xì)胞可作為體外研究HPV特異性免疫反應(yīng)的刺激細(xì)胞。

EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞系;人乳頭瘤病毒;T細(xì)胞克隆

Epstein Barr病毒(Epstein Barr virus,EBV)可在體外感染人的B淋巴細(xì)胞,使其形成永生化的B淋巴母細(xì)胞系(lymphoblastoid cell line,LCL)細(xì)胞。LCL細(xì)胞易傳代和長期培養(yǎng),作為抗原提

呈細(xì)胞和靶細(xì)胞已廣泛應(yīng)用于T細(xì)胞克隆的建立[1-3]和擴(kuò)大培養(yǎng)、抗原表位篩選[1-3]、機(jī)體免疫應(yīng)答[2-3]以及EBV相關(guān)腫瘤的免疫治療研究[4-5]。研究證實,高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的首要因素[6-7]。病毒感染后機(jī)體產(chǎn)生的特異性的細(xì)胞免疫在清除病毒感染細(xì)胞和病毒誘導(dǎo)形成的腫瘤細(xì)胞過程中發(fā)揮重要的作用。為研究HPV感染者體內(nèi)特異性的免疫反應(yīng)及鑒定HPV的抗原表位,我們收集HPV感染者的靜脈血,分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),建立EBV-LCL,并應(yīng)用此細(xì)胞系細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞篩選研究HPV特異性T細(xì)胞克隆細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

B95-8細(xì)胞(EBV產(chǎn)生細(xì)胞)和T細(xì)胞克隆細(xì)胞,由美國University of Arkansas for Medical Sciences微生物與免疫學(xué)教研室保存;RPM I1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液為Fisher公司產(chǎn)品;CD14 microbeads和Pan T細(xì)胞分離試劑盒購自MiltenyiBiotec公司;Multiscreen 96孔板為美國Millipore公司產(chǎn)品;IFN-γ單克隆抗體和biotin-標(biāo)記的Anti-IFN-γ單克隆抗體購自瑞典Mabtech公司;avidin-bound biotinylated horseradish peroxidase購自Vector Laboratories公司;EL ISPOT分析儀為Cell Technology公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 EBV的制備 取凍存的B95-8細(xì)胞凍存管1支,常規(guī)方法復(fù)蘇細(xì)胞,用25 mL的完全RPM I1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清,青霉素250 U/ mL,鏈霉素和慶大霉素250μg/mL;RP-10F)培養(yǎng)細(xì)胞,直至培養(yǎng)基變黃。以后每7 d 1∶40傳代。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中,2000 r/min離心20 min,將離心后的上清用0.22μm的濾菌器過濾,濾液中所含病毒直接用于LCL細(xì)胞系的建立或儲存于4℃冰箱中(1～2周)。

1.2.2 PBMC細(xì)胞的分離 收集肝素抗凝的HPV感染者靜脈血40 mL,分裝至2個50 mL離心管中,每管加入15mL的0.9%NaCl,將約15mL Ficoll淋巴細(xì)胞分離液緩慢地加入含有血液的離心管底部,1500 r/min離心25 min。棄去血漿層,將含有PBMC的中間層移至另一新離心管中,0.9% NaCl洗細(xì)胞3次,5 mL RP-10F重懸細(xì)胞,計數(shù)。

1.2.3 non-T淋巴細(xì)胞的分離 按CD14 microbeads試劑盒分離PBMC,收集CD14-細(xì)胞;再按Pan T細(xì)胞分離試劑盒操作分離、收集non-T細(xì)胞,計數(shù)后進(jìn)行EBV轉(zhuǎn)化。

1.2.4 EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴母細(xì)胞系的建立將含有EBV病毒的上清液置于37℃水浴箱中備用。將分離得到的non-T細(xì)胞(主要是B細(xì)胞)離心后重懸于RP-10F培養(yǎng)液中,細(xì)胞計數(shù)后,加入適量體積的EBV病毒懸液(1 mL EBV/1×106B細(xì)胞),充分混勻后,將細(xì)胞移入T25培養(yǎng)瓶中, 37℃、5%CO2培養(yǎng)1.5 h。期間,每30 min晃動培養(yǎng)瓶1次。之后,將細(xì)胞移入離心管中,1500 r/min離心10 min后,棄上清,將沉淀細(xì)胞用4 mL含有環(huán)胞素A(cyclosporin-A,CyA;125 ng/ mL)的RP-10F重懸后轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待培養(yǎng)液變黃后半量換液,重復(fù)1次后,1∶2傳代培養(yǎng)。后續(xù)的培養(yǎng)及傳代均用RP-10F培養(yǎng)液。約4周獲得穩(wěn)定的LCL。

1.2.5 LCL細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 LCL細(xì)胞連續(xù)傳代2個月后,常規(guī)凍存、復(fù)蘇,檢測細(xì)胞活性。

1.2.6 LCL細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞篩選HPV抗原特異性的T細(xì)胞克隆 應(yīng)用EL ISPOT方法,以LCL作為抗原遞呈細(xì)胞篩選可能的HPV抗原特異性的T細(xì)胞克隆。同時使用2塊Multiscreen 96孔板,1塊為實驗板,即用HPV抗原肽刺激T細(xì)胞克隆細(xì)胞;另1塊為陰性對照板,即用RP-5H代替抗原肽刺激T細(xì)胞克隆細(xì)胞。將來自不同T細(xì)胞克隆的細(xì)胞分別置于2塊平板的相同位置。EL ISPOT步驟參考文獻(xiàn)[1-2]。以濃度為5μg/ mL的IFN-γ單克隆抗體包被Multiscreen 96孔板,4℃過夜。次日傾倒包被液,PBS洗滌3次,在滅菌吸水紙上吸干。用50μL/孔完全培養(yǎng)基(RP-5H)37℃封閉2 h。每孔加入50μL LCL細(xì)胞(5×105/孔)、50μL T細(xì)胞克隆細(xì)胞(1×106/孔),50μL HPV抗原肽(10μmol/L)或RP-5H,每個平板均設(shè)陽性(PHA)和陰性對照(RP-5H)。將平板置于37℃、5%CO2條件下過夜培養(yǎng)。用含0.05%Tween-20的PBS洗滌3次,加入濃度為1μg/mL生物素標(biāo)記的Anti-IFN-γ單克隆抗體,37℃孵育2 h。傾倒二抗,用含0.1%Tween-20的PBS洗滌3次,在吸水紙上吸干。加入親和素-生物素辣根過氧化物酶,50μL/孔,37℃孵育1 h。用含0.1%Tween-20的PBS洗滌3次,在吸水紙上甩干,用苯二胺顯色5 min,去離子水洗滌3次終止顯色,自然干燥后EL ISPOT分析儀計數(shù)斑點數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 HPV感染者LCL轉(zhuǎn)化

本實驗中共轉(zhuǎn)化20份,18份轉(zhuǎn)化成功,用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)均超過2.0×106(表1),轉(zhuǎn)化成功率為90%。2例轉(zhuǎn)化失敗,用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)分別為1.6×106和2.0×106(表1)。

表1 用于EBV轉(zhuǎn)化的non-T淋巴細(xì)胞數(shù)量Table 1 The number for non-T lymphocytes for EBV transformation

2.2 LCL形態(tài)及培養(yǎng)特點

EBV轉(zhuǎn)化成功的LCL細(xì)胞體積增大,圓形,細(xì)胞聚集成團(tuán)狀或簇狀生長。細(xì)胞轉(zhuǎn)化初期應(yīng)用含有CyA(125 ng/mL)的RP-10F培養(yǎng)細(xì)胞,2次換液后改用RP-10F。轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞可持續(xù)傳代2個月以上,液氮中凍存復(fù)蘇后,細(xì)胞活性大于90%,復(fù)蘇后細(xì)胞可培養(yǎng)傳代2個月以上。

2.3 LCL作為抗原遞呈細(xì)胞篩選HPV特異性的T細(xì)胞克隆

在檢測的94個T細(xì)胞克隆中有64個為可能的抗原特異性克隆,與陰性對照板比較,這些克隆在實驗板中相應(yīng)孔有明顯的斑點形成,提示這些克隆可能為抗原特異性克隆。實驗結(jié)果表明LCL能有效遞呈抗原肽,供T細(xì)胞識別。

3 討 論

研究證實,EBV感染在人群中廣泛存在,大多數(shù)人在兒童時期感染過EBV,并產(chǎn)生特異性抗體,表明機(jī)體產(chǎn)生了針對病毒的特異性免疫反應(yīng)。在使用PBMC建立LCL過程中,當(dāng)EBV特異性的記憶性T細(xì)胞接觸病毒后被激活,對EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異的殺傷作用,使得形成的淋巴母細(xì)胞集落很快退化。因此,抑制或去除血液中T細(xì)胞活性是建立LCL的關(guān)鍵。

本實驗中采用以下方法去除和抑制PBMC中的T細(xì)胞:①利用Pan T細(xì)胞試劑盒去除PBMC中的T細(xì)胞,收集non-T細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化;②轉(zhuǎn)化初期(1～2周),培養(yǎng)液的量不超過4 mL,保證轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有一定的密度。培養(yǎng)液變黃后半量換液;③培養(yǎng)液中加入CyA(終濃度125 ng/mL),以抑制可能殘留的T細(xì)胞活性,從而增加B細(xì)胞轉(zhuǎn)化的成功率。經(jīng)以上處理后,LCL建株成功率達(dá)90%,遠(yuǎn)高于呂澤平等[8]報道的66.7%。建株失敗的2份標(biāo)本中non-T細(xì)胞數(shù)均少于2×106,可能原因是用于轉(zhuǎn)化non-T細(xì)胞數(shù)少,細(xì)胞相互接觸聚集成團(tuán)的幾率小,因而EBV轉(zhuǎn)化不易成功。

LCL作為抗原遞呈細(xì)胞可用于篩選抗原特異性的T細(xì)胞克隆及鑒定抗原表位[1-3]。本實驗篩選得到了64個可能的抗原特異性的T細(xì)胞克隆,后續(xù)的抗原特異性驗證實驗證實了這些克隆的抗原特異性。

[1]Wang X,Santin AD,Bellone S,et al.A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancerpatients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells[J].Cancer I mmunol I mmunother,2009,58(2):301-308.

[2]Wang X,Moscicki AB,Tsang L,et al.Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16(HPV16)E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable [J].Clin Vaccine I mmunol,2008,15(6):937-945.

[3]Nakagawa M,Gupta SK,Coleman HN,et al.A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results[J].J Low Genit Tract Dis, 2010,14(2):124-129.

[4]SiliU,Huls MH,Davis AR,et al.Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy[J].J I mmunother,2003,26(3):241-256.

[5]Rooney CM,Bollard C,Huls MH,et al.I mmunotherapy for Hodgkin’s disease[J].Ann Ann Hematol,2002,81(Suppl 2): S39-4.

[6]Alboomers JM,Jacobs MV,Manos MM,et al.Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide [J].J Pathol,1999,189(1):12-19.

[7]Zur Hausen H.Papillomavirus infections-a major cause of human cancers[J].Biochim Biophys Acta,1996,1288(2):F55-78.

[8]呂澤平,鄭陳光,楊澤,等.建立巴馬長壽老人經(jīng)EBV轉(zhuǎn)染永生細(xì)胞株的方法[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2002,19(5): 624-626.

Establishment and Application of EBV-Transformed B Lymphoblast Cell Line from HPV Infected Persons

WANG Xue-lian1,WANG Zuo-zhou2,AN Chun-li1,SONG Yang3
(1.Teach.&Res.Div.Patho.Biol.;2.Teach.&Res.Div.of Pathology; 3.Expert’l Center of the Functional Subjects,Coll.of Basic Med.Sci.,China Med.Uni.,Shenyang110001)

An EBV-transformed Blymphoblast cell line(LCL)was established and applied the cell line as a presenting cells to screen antigen-specific T cell clone.Peripheral blood mononuclear cells(PBMC)were isolated from 20 blood specimens from women infected human papillomavirus(HPV)and T cells were depleted from PBMC by Pan T cell isolation kit.Non-T cells lymphocyte were obtained and transformed with EBV.HPV-specific T cell clones were screened using LCL as antigen presenting cells.The results showed that 18 LCLs were established successfully.Cell volume expansion and clustered growth were observed in LCL cells.The number of non-T cell was less than 2×106for two specimen unable to establishLCL.64 HPV-specific T cell clones were selected.Therefore,LCLs were successfully established and they could serve as stimulating cells in specific immune response to HPV.

EBV-transformed Blymphoblast cell line;human papillomavirus(HPV);T cell clone.

R373

A

1005-7021(2010)06-0018-04

遼寧省教育廳科研項目(L2010579和2008738);教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金資助項目(教外司留【2010】1174號)

王雪蓮 女,副教授?，F(xiàn)從事人乳頭瘤病毒相關(guān)疾病的基因及免疫治療研究。E-mail:wxlcmu@hotmail.com

＊通訊作者。E-mail:xiaohaozi123@yahoo.com

2010-10-09;

2010-10-25