1株白木香內生真菌中抗腫瘤活性成分的分離純化和結構鑒定

李冬利,陳玉嬋,李義勇,2,陶美華,章衛民＊

(1.廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應用重點實驗室廣東省微生物應用新技術公共實驗室,廣東廣州 510070; 2.三峽大學化學與生命科學學院湖北省天然產物研究與利用重點實驗室,湖北宜昌 443002)

1株白木香內生真菌中抗腫瘤活性成分的分離純化和結構鑒定

李冬利1,陳玉嬋1,李義勇1,2,陶美華1,章衛民1＊

(1.廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應用重點實驗室廣東省微生物應用新技術公共實驗室,廣東廣州 510070; 2.三峽大學化學與生命科學學院湖北省天然產物研究與利用重點實驗室,湖北宜昌 443002)

采用活性追蹤的方法對白木香內生真菌螺旋木霉Trichoderma spiraleA17的抗腫瘤活性代謝產物進行了分離純化和結構鑒定。通過凝膠柱層析和反相硅膠柱層析,從其發酵液的活性組分中分離到2個無色針晶化合物,質譜和核磁共振的鑒定結果表明化合物1是一個八氫萘衍生物,命名為木霉酸(Trichodermic acid),化合物2是酪醇(Tyrosol)?；钚詫嶒烇@示化合物1對SF-268、MCF-7和NCI-H4603種腫瘤細胞株都具有顯著的增殖抑制活性,而化合物2對這3種腫瘤細胞株只有微弱的增殖抑制活性。

白木香;內生真菌;螺旋木霉;抗腫瘤;活性追蹤

植物內生真菌能產生結構豐富多樣的次級代謝產物,這些代謝產物的結構有些與宿主的某些代謝產物相同或相似,有些是其他具有潛在藥用價值的次生代謝產物,并且容易從中發現新穎結構的化合物,已成為發現新天然活性物質的重要資源。近年來在植物內生真菌中發現的活性產物的結構類型主要有萜類、生物堿類、醌類、黃酮類、異香豆素類、內酯類、木脂素類、酚類、多肽類、甾體化合物等[1],報道的生物活性有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗瘧、抗病毒、殺蟲、酶抑制劑、調節植物生長等[2],在醫藥、農業和工業等各個領域都展現出良好的應用前景。利用植物內生真菌生產活性物質的一個顯著優勢在于資源的可持續利用,對自然資源破壞極少,能夠解決自然資源不足的問題,這一點對于某些珍貴瀕危的藥用植物來說顯得更加重要。白木香(Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg.)別名土沉香、女兒香、莞香,為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)植物,是一種熱帶及亞熱帶常綠喬木,為我國華南地區特有的珍貴藥用植物,也是我國生產中藥沉香的唯一的資源植物。《廣東珍稀瀕危植物》報告[3],廣東省的野生大型白木香由于砍伐過度,已經十分稀有,瀕臨絕種。因此,對白木香內生真菌及其活性代謝產物的研究,具有重要的生態學意義和經濟價值。王磊等[4]從采自廣東省不同組織年齡的白木香根、莖、葉以及天然結香部位分離獲得了50株內生真菌,對其代謝產物進行了抗腫瘤抗菌活性篩選,得到了幾株具有較好生物活性的目標菌株[5]。螺旋木霉Trichoder m a spiraleA17是其中1株具有較好抗腫瘤和抗菌活性的菌株。本研究采用活性追蹤的方法對其抗腫瘤活性代謝產物進行分離純化和結構鑒定,為尋找抗腫瘤藥物或藥物先導化合物提供物質基礎,為開發利用白木香內生真菌資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 白木香內生真菌A17為本實驗室從廣東省信宜市南屯野生白木香(約30 a樹齡)的根部分離得到[4],保存于廣東省微生物研究所。經形態學鑒定和分子鑒定,該菌株為螺旋木霉(Trichoderma spirale)。

1.1.2 細胞株來源 神經膠質瘤細胞SF-268、乳腺癌細胞MCF-7和大細胞肺癌細胞NCIH460,均由江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室蔣繼宏教授提供。

1.1.3 儀器和試劑 ①主要儀器:核磁共振波譜儀500MHz,Bruker公司;質譜儀API 2000 LC/ MS/MS,MDS SCIEX公司;PZ1000B旋轉式大容量普通搖床,武漢瑞華儀器設備有限公司;RE-2000型旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D (Ⅲ)型循環水式真空泵,鞏義市英峪予華儀器廠;DLSB-5/10低溫冷卻液循環泵,鄭州長城科工貿有限公司;Hangping FA2004電子分析天平,上海天平儀器廠;超凈工作臺,上海恒益科技有限公司;②主要試劑:柱層析硅膠(100～200目,200～300目)、GF254高效薄層硅膠板,青島海洋化工廠; C18反相硅膠(40～75μm),Fuji Silysia Chemical Ltd.;凝膠Sephadex LH-20(18～110μm),Amersham Biosciences;石油醚(分析純),天津市瑞金特化學品有限公司;乙酸乙酯(分析純),天津富宇精細化工有限公司;三氯甲烷(分析純),廣州化學試劑廠;甲醇(分析純)天津市瑞金特化學品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乙酸乙酯粗提物的制備 從保藏菌株的試管斜面挑取少許菌絲分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)平板上活化3 d,然后將活化的菌絲接種于裝有250 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基的500 mL的三角瓶中,28℃,120 r/min培養3 d,作為種子液。大量發酵同樣采用馬鈴薯葡萄糖液體培養基,每只500 mL搖瓶裝250 mL的培養基,共培養120瓶。28℃,120 r/min培養7 d,發酵結束后過濾得發酵液,用乙酸乙酯萃取4次,合并乙酸乙酯相于40℃下減壓濃縮至膏狀,得乙酸乙酯相粗提物(約1.9 g)。

1.2.2 粗提物的初步分離 乙酸乙酯相粗提物通過正相硅膠柱進行初步分離。干法上樣,以石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇洗脫系統進行梯度洗脫,分段收集。用薄層層析(TLC)檢測(顯色劑為茴香醛-濃硫酸試劑),合并相似組分,濃縮干燥得12個粗組分(F1～F12)。

1.2.3 粗組分的抗腫瘤活性測定 供試腫瘤細胞株為SF-268,參考李浩華等[6]采用MTT法測定各粗組分的抗腫瘤活性以確定活性組分。

1.2.4 活性組分中化合物的分離純化 采用凝膠柱層析和反相硅膠柱層析對活性組分進行化學成分的分離純化。

1.2.5 純化合物的結構鑒定 通過核磁共振(NMR)和質譜(MS)技術對所得純化合物的結構進行鑒定。

1.2.6 純化合物的抗腫瘤活性測定 供試腫瘤細胞株為SF-268、MCF-7和NCI-H460,采用MTT法測定所得純化合物的抗腫瘤活性。

2 結 果

2.1 粗組分的抗腫瘤活性

在100μg/mL的作用濃度時,各粗組分對SF-268細胞增殖的抑制率見表1。組分F2表現出最強的抑制活性,TLC檢測顯示其含有2個主要化學成分。因此選擇F2組分進行進一步的分離純化。

表1 粗組分對SF-268細胞增殖的抑制率(ˉχ±S,n=3)Table 1 Inhibitory rates of rough fractions on SF-268(ˉχ±S,n=3)

2.2 活性物質的分離純化

活性組分F2(90.4 mg)先通過凝膠柱層析(Sephadex LH-20,甲醇洗脫)分為F2-1(46.2 mg)和F2-2(10.3 mg)。F2-1和F2-2再分別通過C18反相硅膠柱層析(ODS-A,甲醇洗脫)得到純化合物1(無色針晶,22.6 mg)和純化合物2(無色針晶,9.0 mg)。

2.3 結構鑒定

2.3.1 化合物1的結構鑒定 化合物1進行電噴霧電離質譜(ESI-MS)分析,結果顯示:陰離子模式出現m/z:303[M-H]-、607[2M-H]-2個峰,陽離子模式出現m/z:305[M+H]+、327[M+ Na]+、609[2M+H]+、631[2M+Na]+幾個主要峰,因此初步推斷化合物的分子量為304。化合物1的1H-NMR圖譜上(表2)低場區顯示有5個不飽和氫信號,根據偶合常數(J)可以判斷其中有3個為互相連接的反式雙鍵氫(J=14.9、11.2 Hz),另2個為一對順式雙鍵氫(J=9.5 Hz)。高場區顯示4個甲基信號,其中1個單峰表示與不飽和季碳相連,另外3個均為雙重峰,均與飽和次甲基相連。高場區還有一些飽和氫信號。13CNMR(表2)和無畸變極化轉移增強(DEPT)圖譜上可以看到19個碳信號,包括2個季碳,12個次甲基,1個亞甲基和4個甲基。綜合質譜、核磁數據確定該化合物分子式為C19H28O3。通過同核化學位移相關譜、異核單量子相干譜和異核遠程化學位移相關譜(1H-1H COSY、HSQC和HMBC)等二維核磁共振(2D-NMR)數據,鑒定1的結構如圖1所示,該化合物屬于八氫萘衍生物。其相對構型通過核Overhauser效應譜(NOESY)確定,H-1、H-3、H-5、H-8、H-9等有相關峰,顯示它們處于分子的同一側,H-2、H-4a、H-10有相關峰,顯示它們同處于分子的另一側。由文獻[7]可知,該化合物為已知化合物,化學名為(2E,4E)-5-((1S, 2S,4aR,6R,7S,8S,8aS)-7-hydroxy-2,6,8-trimethyl-1,2,4a,5,6,7,8,8a-octahydronaphthalen-1-yl)-2-methylpenta-2,4-dienoic acid。此前,只有Yamada報道從1株未定種的木霉屬真菌中分離得到過該化合物,本研究的核磁數據與其一致,本文將該化合物命名為木霉酸(Trichodermic acid)。

表2 化合物1的氫譜碳譜核磁數據(溶劑為氘代甲醇,單位為×10-6)Table 2 1H-and13C-NMR spectral data of compound 1(CD3OD,×10-6)

圖1 化合物1的結構式和主要的1H-1H COSY(粗線)、HMBC(箭頭)相關關系Fig.1 Structure and key1H-1H COSY(bold line) and HMBC(arrow)correlations of compound 1

2.3.2 化合物2的結構鑒定 化合物2的1HNMR譜上低場區顯示2個雙峰(δH:7.05和6.74),每個峰代表2個氫,從它們之間的偶合常數8.1 Hz可以判斷是位于苯環鄰位的兩組氫,由此可以判斷一個對位取代苯環的存在。另外高場區顯示有2個三重峰信號(δH:3.69和2.71),每個峰代表2個氫,偶合常數都為7.1 Hz,可見為2個互相連接的亞甲基,并且其中一個亞甲基與含氧基團相連,另一個亞甲基與不飽和基團相連。13C-NMR和DEPT圖譜上可以看到6個碳信號, δC:116.0～156.6之間的4個信號應該是一個苯環,包括2個季碳信號,其中δC:156.6處的季碳連接含氧基團,另包括2個次甲基信號,分別代表苯環上未被取代的2個次甲基;此外,13C-NMR圖譜上另2個為亞甲基信號(δC:64.3和39.5),其中δC:64.3處亞甲基應與含氧基團相連。因此,結合核磁共振氫譜和碳譜數據,確定該化合物為酪醇(Tyrosol),譜圖數據與文獻[8]報道一致。

圖2 化合物2的結構式Fig.2 Structure of compound 2

2.4 純化合物的抗腫瘤活性

在20μg/mL的作用濃度時,2個純化合物對SF-268、MCF-7和NCI-H460腫瘤細胞的增殖抑制活性表現出明顯差異(表3)?；衔?對3種細胞株都表現出較強的抗腫瘤活性,抑制率均在50%以上;而化合物2對3種細胞株的抑制作用都較弱。

表3 化合物1和2對3種細胞株增殖的抑制率(%) ±S,n=3)Table 3 Inhibitory rates of compounds 1and 2 on three tumor cells(%)±S,n=3)

表3 化合物1和2對3種細胞株增殖的抑制率(%) ±S,n=3)Table 3 Inhibitory rates of compounds 1and 2 on three tumor cells(%)±S,n=3)

注:陽性對照為順鉑水溶液,作用濃度為10μg/mL

細胞株SF-268MCF-7NCI-H460化合物172.4±0.553.4±1.059.8±3.7化合物21.9±1.29.4±1.36.8±1.4陽性對照93.0±2.097.6±0.898.4±1.0

3 討 論

本研究通過活性追蹤的方法從白木香內生真菌螺旋木霉A17發酵液的乙酸乙酯相粗提物中得到了具有抗腫瘤活性的八氫萘衍生物—木霉酸。該化合物盡管為已知化合物,但迄今只有Yamada[7]曾經分離得到。本研究首次從螺旋木霉中得到該化合物,并首次發現其對SF-268、MCF-7和NCI-H4603種腫瘤細胞株具有明顯的增殖抑制活性。

細胞黏附分子(Cell adhesion molecules, CAMs)是由細胞產生的介導細胞與細胞間或細胞與細胞外基質之間相互作用的一類膜表面糖蛋白分子。它參與細胞的信號傳導與活化,細胞的伸展和移動,細胞的生長及分化,炎癥、血栓形成,腫瘤轉移及創傷愈合等一系列重要的生理和病理過程。細胞間黏附分子1(ICAM-1)屬于CAMs中的免疫球蛋白超家族成員之一,是一種細胞表面的跨膜糖蛋白。已證實ICAM-1與免疫應答、炎癥反應、淋巴細胞歸巢和再循環、腫瘤以及動脈粥樣硬化等相關。Yamada[7]發現,木霉酸及其通過化學反應生成的衍生物能夠抑制I CAM-1的表達,其中有一個衍生物具有很好的治療炎癥性疾病和類風濕性關節炎的作用,并且對A549、PC-3、As-PC-1和HT1080等腫瘤細胞的增殖抑制活性遠遠好于對Hepatocyte、NHDF和BAE等正常細胞的活性。因此以木霉酸及其衍生物作為I CAM-1表達抑制劑、炎癥性疾病治療劑、類風濕性關節炎治療劑、免疫抑制劑和細胞增殖抑制劑申請了專利。本研究發現木霉酸對SF-268、MCF-7和NCI-H4603種腫瘤細胞株也具有顯著的增殖抑制活性,說明它可能具有較廣譜的抗腫瘤活性,其抗腫瘤活性是否可能與其對I CAM-1的表達抑制活性相關值得進一步探討。另一方面,本研究從內生真菌螺旋木霉中發現了木霉酸,為木霉酸的來源提供了一種新資源,為利用木霉酸生產藥用衍生物提供了新的資源基礎。

從SciFinder Scholar數據庫發現,與木霉酸結構最類似的化合物為coprophilin,區別只在于側鏈上甲基位置的不同。coprophilin具有抗雞球蟲(Eim eria tenella)的作用[9],而雞球蟲病是一種寄生蟲病,在世界上普遍發生,是造成集約化養雞業生產經濟損失的主要因素之一[10]。因此可以利用螺旋木霉生產木霉酸,然后通過化學反應獲得一系列衍生物,并測試木霉酸及其衍生物的抗球蟲活性,也許可以從中發現有效的抗球蟲藥物,從而產生良好的經濟效益。

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[5]李冬利,張慶波,陳玉嬋,等.白木香內生真菌抗腫瘤抗菌活性的篩選研究[J].微生物學雜志,2009,29(5):26-29.

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Isolation and Identification of Anti-Tumor Constituents from an Endophytic Fungus of Baimuxiang(Aquilaria sinensis)

LI Dong-li1,CHEN Yu-chan1,LI Yi-yong1,2,TAO Mei-hua1,ZHANG Wei-min1
(1.Guangdong Prov.Open Lab.of Appl.Microbiol.,Guangdong Prov.Key Lab.of Microb.Cult.Collect.and Appl.,Guangdong Inst.of Microbiol.,Guangzhou510070; 2.Hubei Key Lab.of Nat.Prod.Res.&Devel.,Coll.of Chem.and Life Sci.,China Three Gorges Uni.,Yichang443002)

Adopting activity trailing method,anti-tumor active metabolites from the endophytic fungus Trichoderma spiraleA17 in officinal baimuxiang(Aquilaria sinensis)were isolated and identified.Column chromatography on Sephadex LH-20 and C18 silica gel was used,and two kinds of colorless needle crystallized compound were obtained from the active constituent of fer mentation broth.Data analysis of mass spectrometry and nuclear magnetic resonance, indicated the compound 1 was an octo-hydrogen derivative of naphthalene and named as trichodermic acid,and compound 2 was tyrosol.Compound 1 showed significant inhibitory activities against tumor cells SF-268,MCF-7,and NCI-H460,while compound 2 displayed onlyweak hyperplasia inhibition activities against these tumor cells.

Aquilaria sinensis;endophytic fungi;Trichoderma spirale;antitumor;activity trailing

R73-3;R284

A

1005-7021(2010)06-0001-05

國家自然科學基金(20902014);廣東省自然科學基金(9451007002003074);廣州市科技計劃項目(09B34061446);廣東省科學院優秀青年科技人才基金

李冬利 女,助理研究員,博士。研究方向為微生物活性代謝產物。

Tel:020-87688612,E-mail:yichen802003@yahoo.com.cn

＊通訊作者。Tel:020-37656321,E-mail:wmzhang58@yahoo.com.cn

2010-09-19;

2010-11-22