泥蚶凝集素的抑菌作用和免疫學研究

柯佳穎, 陳寅山, 戴聰杰

（1. 泉州師范學院 化學與生命科學學院, 福建 泉州 362000; 2. 福建師范大學 生命科學學院, 福建 福州 350007）

泥蚶凝集素的抑菌作用和免疫學研究

柯佳穎1, 陳寅山2, 戴聰杰1

（1. 泉州師范學院 化學與生命科學學院, 福建 泉州 362000; 2. 福建師范大學 生命科學學院, 福建 福州 350007）

分別從泥蚶血淋巴液和肌肉中提取出凝集素, 采用全血微量培養法進行淋巴細胞轉化和抑菌實驗。結果表明: 兩種凝集素都具有促進小鼠淋巴細胞轉化的免疫調節功能; 兩種凝集素對供試的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）, 甘薯薯瘟病原細菌（Fasarium oxyssporam）, 大腸桿菌（Escherichia coli）, 普通變形桿菌（Proteas valgaris）, 八疊球菌（Sarcina lutea）5種細菌和啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）, 玉米大斑病菌（Helminthos porium turcicum）, 稻瘟病菌（Piricularia oryzae）3種真菌都有不同程度的抑制作用, 且對真菌的抑制作用大于對細菌的抑制作用; 由二者分別制備的抗血清通過免疫雙擴散法并不能與對方發生交叉沉淀反應, 說明它們不具有同源性。

泥蚶（Tegillarca granosa Linnaeus）; 凝集素; 免疫活性; 抑菌作用

凝集素由于具有獨特的生化性質[1,2], 通常被應用于分離和鑒定糖蛋白和糖脂、研究細胞組化、細胞分型、分離淋巴細胞和骨髓細胞、疾病患者的免疫狀態評估等方面[3]。近年來國內外學者針對其分離純化、結構和生物學功能等進行了大量的研究[4～6],但有關凝集素對病原菌的作用和免疫調節功能的研究尚未見報道[7～9]。

泥蚶（Tegillarca granosa Linnaeus）, 俗稱花蚶、血蚶等, 是棲息于沿海灘涂的廣溫性雙殼類軟體動物, 由于其營養豐富、味道鮮美, 深受大眾喜愛[10],現為我國山東、江蘇、浙江、福建和廣東沿海等地的大宗養殖品種。本工作研究了泥蚶血清凝集素（TGL-h: The hemolymph lectin of T. granosa）和泥蚶肌肉凝集素（TGL-m: The muscle lectin of T. granosa）對作物病害的抑制作用和免疫調節功能, 旨在深入研究泥蚶的免疫學機制, 促進其養殖業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用泥蚶購自福州市程埔市場; 兔和小鼠購自福建醫科大學; 實驗用菌均取自福建師范大學生命科學學院微生物學實驗室。

層析用膠為Pharmacia產品; RPMI1640培養液為HyClone公司產品; 姬姆薩氏色素由Chroma公司進口分裝; 福氏佐劑、福氏不完全佐劑為BBI產品; 瓊脂為上海生物工程公司產品, 其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 泥蚶凝集素的制備

參照文獻[11]、[12]制備泥蚶血清凝集素（TGL-h）和泥蚶肌肉凝集素（TGL-m）。為了提高純度,用葡聚糖凝膠Sephadex G-100進行兩次凝膠過濾。

1.2.2 淋巴細胞轉化實驗

按劉祖洞等[13]的全血微量培養法, 將15只健康昆明種小鼠隨機分成2個實驗組和1個對照組, 每組5只。在無菌條件下眼眶取血 0.3 mL, 加肝素（500單位/mL）抗凝, 放入 5 mL含 20%小牛血清 RPMI 1640培養液中, 其中 2個用藥組培養液中另加質量濃度為0.25 mg/mL的TGL-h或TGL-m各200 μL, 每天搖動 2～3次, 于 37℃下培養 72 h后, 取出涂片,姬姆薩染色計數。淋巴細胞轉化率平均轉化率均用平均數±標準差表示, 并用t檢驗進行差異分析。

1.2.3 菌類生長抑制實驗

1.2.3.1 抑菌實驗

將TGL-h或TGL-m分別配置成濃度為100 mol/mL的溶液, 測定其抑菌活性。采用圓形紙片法[14],用接種環分別從 8種受試菌（5種細菌: 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）, 甘薯薯瘟病原細菌（Fasarium oxyssporam）, 大腸桿菌（Escherichia coli）;普通變形桿菌（Proteas valgaris）, 八疊球菌（Sarcina lutea）; 3種真菌: 啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）, 玉米大斑病菌（Helminthos porium turcicum）,稻瘟病菌（Piricularia oryzae））的斜面上刮取一環菌苔, 洗入5 mL無菌水中, 充分振蕩搖勻, 得菌懸液。將細菌菌懸液倒入牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基中, 真菌菌懸液倒入馬鈴薯瓊脂培養基中, 搖勻后分裝到培養皿中。取消毒過的圓形濾紙片（直徑約6 mm）, 分別浸漬泥蚶血清或肌肉凝集素, 貼于瓊脂平板上,共貼6枚紙片。培養后觀測抑菌圈寬度的大小, 每一樣品重復2次, 取平均值。

1.2.3.2 最小抑菌濃度的測定

采用同上的圓形紙片法, 將TGL-h或TGL-m進行梯度稀釋, 以未見抑菌圈的最低濃度為最小抑菌濃度。

1.2.4 泥蚶凝集素血清學性質

1.2.4.1 抗血清的制備[15]

選用 2～3 kg新西蘭雄性大白兔進行皮下免疫注射, TGL-h或TGL-m 0.5 mg/只; 20 d后再次加強TGL-h或TGL-m 0.35 mg/只; 最后間隔兩周耳靜脈注射0.1 mgTGL-h或TGL-m。7 d后取血得抗血清。1.2.4.2 雙相免疫擴散實驗

制備 1.2%瓊脂凝膠擴散板, 按梅花形打孔, 將濃度約為1 mol/mL的TGL-h或TGL-m加入中央孔,外周各孔則按順時針方向加入各抗血清, 并留一孔加入生理鹽水作為對照。考馬斯亮藍染色, 以出現沉淀線的抗血清最高稀釋度為其效價。

2 實驗結果

2.1 淋巴細胞轉化

圖 1顯示了小鼠淋巴細胞轉化前后細胞形態上的變化。體積較小的細胞是未轉化的小淋巴細胞, 其染色質呈深藍色; 體積增大的淋巴細胞是轉化后的原始型淋巴母細胞, 為小淋巴細胞的 3～4倍, 其核內染色質疏松呈細網狀, 著色較淺, 核內可見明顯的核仁0～4個。

經過對兩種凝集素對小鼠淋巴細胞轉化的結果比較分析（表 1）, TGL-h的轉化率和有絲分裂率分別比空白對照組提高了50.44%和20.15%; 而TGL-m的轉化率和有絲分裂率則分別比空白對照組提高了73.59%和41.03%, 說明泥蚶凝集素均能明顯促進小鼠淋巴細胞的轉化。統計結果表明, TGL-h轉化率與生理鹽水對照組有極顯著差異（P＜0.01）, 有絲分裂率則有顯著差異（P＜0.05）; TGL-m轉化率和有絲分裂率均明顯高于生理鹽水對照組（P＜0.01）, 說明 TGL-m比 TGL-h更有效增強細胞免疫功能, 促進小鼠淋巴細胞的轉化。

圖1 小淋巴細胞轉化為淋巴母細胞的照片（×400）Fig. 1 Murine lymphocyte transformation（×400）

2.2 菌類生長的抑制實驗結果

2.2.1 抑菌活性

TGL-h和TGL-m對細菌和真菌都顯示出了不同程度的抑制作用（表2）。在供試的5種細菌中, TGL-h對 4種菌都有抑制作用, 其中對大腸桿菌的抑制作用最大, 抑菌圈寬度達 6.8 mm, 其次為金黃色葡萄球菌, 抑菌圈寬度為 5.4 mm, 對甘薯薯瘟病原菌不敏感; TGL-m對3種細菌有抑制作用, 其中對普通變形桿菌抑制作用最強, 抑菌圈寬度為 6.7 mm, 其次為八疊球菌, 其抑菌圈寬度為 6.0 mm, 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌不敏感。兩種凝集素對供試的 3種真菌均表現出了較強的抑制作用。TGL-h稻瘟病菌的抑制作用最強, 抑菌圈寬度達 6.3 mm; 而TGL-m對啤酒酵母的抑制作用最強, 抑菌圈寬度為7.0 mm。兩種泥蚶凝集素對真菌的抑制作用大于對細菌的抑制作用。

2.2.2 最小抑菌濃度

TGL-h和TGL-m的最小抑菌濃度存在一定的差異（表 3）。TGL-h對大腸桿菌的最小抑菌濃度最低,僅6.25 mol/mL, 抑制強度隨凝集素濃度的減小而減弱（圖2）; 同樣條件下其抑制啤酒酵母的生長則需50 mol/mL的濃度。TGL-m濃度為6.25 mol/mL時, 也可觀察到對普通變形桿菌和啤酒酵母的抑制作用,抑制強度也隨凝集素濃度的減小而減弱（圖 3）; 其抑制甘薯薯瘟病原細菌的生長也需50 mol/mL的濃度。

表1 泥蚶凝集素對小鼠淋巴細胞轉化的影響Tab.1 Effect of TGL on murine lymphocyte transformation

表2 泥蚶凝集素的抑菌活性Tab. 2 Antimicrobial activities of TGLa

表3 泥蚶凝集素的最小抑菌濃度Tab. 3 Minimum antimicrobial concentrations of TGL

圖2 泥蚶血清凝集素抑制大腸桿菌的活性Fig. 2 Activitie of TGL-hemolymph against Escherichia coli

2.3 凝集素血清學性質

2.3.1 泥蚶凝集素抗血清的制備及效價測定

用TGL-h和TGL-m經過3次兔肌肉注射后, 得到的抗血清經瓊脂擴散實驗測定, 它們能與其相應的抗體結合出現明顯的沉淀帶, 效價分別為 1:32和1:16。

2.3.2 泥蚶凝集素免疫交叉反應

在梅花形打孔的中央孔加入抗血清, 周圍孔按對角線位置加入TGL-h和TGL-m, 觀察到TGL-h免疫得到的兔抗血清（中央孔）只能與 TGL-h（孔 1、4）產生沉淀線, 與 TGL-m（孔 2、5）不能形成免疫沉淀線（圖 4）。而同樣用兔抗 TGL-m（中央孔）的血清和TGL-m（孔 2、5）能發生免疫反應, 同TGL-h（孔 1、4）之間無沉淀線（圖5）。

圖3 泥蚶肌肉凝集素抑制普通變形桿菌（a）和啤酒酵母（b）活性Fig. 3 Antimicrobial activities of TGL-muscular against Proteas valgaris （a） and TGL-muscular against Saccharomyces （b）

圖4 兔抗泥蚶血清凝集素血清交叉免疫雙擴散Fig. 4 Crossed double immunodiffusion of antiserum against TGL-hemolymph

圖5 兔抗泥蚶肌肉凝集素血清交叉免疫雙擴散Fig. 5 Crossed double immunodiffusion of antiserum against TGL- muscular

3 討論

凝集素在貝體內的分布有兩種類型: 一類是體內不同部位含有相同性質但含量不等的凝集素。如在紫石房蛤（Saxidomuspurpuratus）的外套膜、足、閉殼肌、水管、鰓及消化器官內含有相同性質的凝集素, 以外套膜和足內的含量最高, 而在消化器官中最低。另一類是體內不同部位含有不同性質凝集素。余萍等[16]發現河豚的肝臟和卵巢所含的凝集素種類不同。朱呈智等[17]曾從粘蟲幼蟲體內提取兩種以上的凝集素; Lothar Ren等[18]從鰻魚血清中分離純化出兩種凝集素: MBL和FBL。對凝集素生物不連續性的研究多數集中在最適溫度、pH方面的研究[19,20]。筆者在實驗中也發現在泥蚶的不同部位存在兩種天然凝集素, 其理化性質有較大差異, 本文是從免疫學的角度研究二者的同源關系。雙向免疫擴散實驗不僅可對抗原或抗體進行定性鑒定和測定效價, 還可對兩種不同來源的抗原或抗體進行比較, 分析其所含成分的異同[15]。早在1980年Yoshida K等[21]就通過免疫擴散發現從同一種植物中分離出的糖結合專一性不同的凝集素之間沒有兔疫交叉反應, 如草藤凝集素（Vicia cracca lectin）VCLI的抗血清不與VCLII作用。實驗中雖然TGL-h和TGL-m來自于同一材料, 但兔抗TGL-h血清只能與TGL-h產生沉淀線, 與 TGL-m 卻不能形成免疫沉淀線; 同樣的, 兔抗 TGL-m血清和 TGL-m能發生免疫反應, 但同TGL-h之間無沉淀線, 說明兩者抗原特性不同, 沒有同源性, 是兩類不同的物質。凝集素在泥蚶體內表現出的特異性筆者認為主要是二者在蛋白質構象上存在較大差別[11,12], TGL-h分子質量約為123 ku, 為兩個亞基的蛋白質, 其相對分子質量分別為15 ku和16 ku, 而TGL-m分子質量約為238 ku, 為單個亞基的蛋白質, 其相對分子質量為60 ku。

分布在全身體液和組織中的淋巴細胞、漿細胞和巨噬細胞能夠對外源細胞表面的抗原起識別功能,從而發現是非己細胞, 產生免疫排斥反應, 是機體維持免疫功能的基本保證。許多研究表明, 一些非特異性抗原, 如刀豆球蛋白A、美洲商陸等有絲分裂素有高度的調理作用[22], 可以刺激小淋巴細胞轉化為母細胞[23], 調理巨噬細胞的吞噬活性。如貽貝的一種凝集素能使其血細胞增強對酵母細胞的吞噬作用,促使入侵者被主體確認。擬菊海鞘血淋巴中對乳糖有特效的凝集素即HA-2使顆粒物更有效地被攝取。本實驗采用全血微量培養的淋轉實驗測定TGL-h和TGL-m對細胞免疫的調節作用, 結果發現二者均能明顯地促進小鼠淋巴細胞的轉化, 促進淋巴細胞分裂, 不失為兩種較為理想的促有絲分裂原和細胞轉化刺激物, 在治療免疫功能低下方面可能具有一定的應用價值。

從雙殼類體內分離凝集素進行抗菌活性的研究目前還比較少, 大多都是直接抽取貝類血淋巴進行實驗。魏玉西[24]報道菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）血淋巴中對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和鰻弧菌（Vibrio anguillarum）具有較強的抗菌活性; 貽貝（Mytilus edulis）血淋巴對金黃色葡萄球菌和四聯微球菌（Micrococcus tetragenus）有抑菌活性;毛蚶（Scapharca subcrenata）血淋巴中含有對金黃色葡萄球菌和鰻弧菌有抑菌活性的物質。實驗中TGL-h和TGL-m對革蘭氏陽性與陰性細菌均有一定的凝集作用, 其機制可能就是凝集素通過與暴露在細菌表面的GlcNAc基團結合, 來識別革蘭氏陽性菌的磷壁酸及革蘭氏陰性菌的脂多糖, 從而使某些細菌發生凝集反應。凝集素作為無脊椎動物一種重要的體液免疫因子, 擁有專一性受體識別因子, 它們通過與糖蛋白或糖脂相互作用凝集細胞或沉淀糖綴合物的碳水化合物結合蛋白或糖蛋白。因此凝集素可充作識別分子, 識別自身和非自身物質, 并具有化學趨化性使之向病原體移動, 并伴隨著吸附作用最終將病原體吞噬, 從而在貝類的免疫防御中起著重要的作用[25]。

從本實驗結果可以看出, 我國沿海的泥蚶具有較強的促進免疫活性等生物學功能, 應進一步加以研究和利用。目前, 筆者對 TGL的結構分析和活性作用機理等方面的研究正在進行中, 以期揭示其細胞識別的分子生物學機理。

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Received: Nov, 6, 2009

Key words:Tegillarca granosa; lectins; antibacterial activity; immunological properties

Abstract:Lymphocyte transformation and antimicrobial experiment were tested with two lectins （TGL-h and TGL-m）, which were extracted from hemolymph and muscle ofTegillarca granosa. These two lectins had immune-regulating function in lymphocyte transformation; in addition, they showed different degrees of inhibition of five bacteria,Staphylococcus aureusFasarium oxyssporam,Escherichia coli,Proteas valgaris, andSarcina lutea,and three fungi,Saccharomyces carlsbergensis,Helminthos porium turcicum, andPiricularia oryzae. The inhibition of fungi was greater than the inhibition of bacteria. The two antisera did not cross-react in double immunodifusion experiments, indicating that these two lectins do not have homology.

（本文編輯:康亦兼）

The antibacterial activity and immunological properties of lectins from Tegillarca granosa Linnaeus

KE Jia-ying1, CHEN Yin-shan2, DAI Cong-jie1
（1. Bioengineering Depatrment, Quanzhou Normal University, Quanzhou 362000, China; 2. College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China）

Q959.215+.2

A

1000-3096（2010）11-0035-06

2009-11-06;

2010-04-15

福建省教育廳A類科技項目（JA09213）; 福建省高校服務海西建設重點項目（No. A101）; 泉州師范學院重點學科項目（No. XK0609）;泉州師范學院大學生科研基金項目（2009DA023）

柯佳穎（1981-）, 女, 福建泉州人, 碩士, 講師, 主要從事生物化學研究, 電話: 0595-22288062, E-mail: kejiaying2003@163.com