香豆素類熒光探針在檢測方面的研究進展

劉江張小琴韓雋劉俊彪黃鋒馬彬彬王宇光

（1.浙江工業大學生物與環境學院,浙江 杭州310011；2.江蘇七洲綠色化工股份有限公司,江蘇 張家港215600）

分析測試

香豆素類熒光探針在檢測方面的研究進展

劉江1張小琴1韓雋2劉俊彪2黃鋒1馬彬彬1王宇光1

（1.浙江工業大學生物與環境學院,浙江 杭州310011；2.江蘇七洲綠色化工股份有限公司,江蘇 張家港215600）

香豆素類衍生物具有很好的熒光性能，所以香豆素類熒光探針的開發利用受到越來越廣泛的關注，如單胺氧化酶、過氧化氫、β-內酰胺酶基因等熒光探針。

香豆素；熒光探針；單胺氧化酶

0 前言

熒光探針指的是一類在紫外-可見-近紅外區有特征熒光，并且其熒光性質（激發和發射波長、強度、壽命、偏振等）可隨所處環境的性質，如極性、折射率、粘度等改變而靈敏地改變的熒光性分子。熒光探針的優點有很多，比如說它有很高的靈敏度和選擇專一性，反應時間短，樣品不需要復雜的提純，不具有破壞性等等[1]，在分析化學，特別是在生物分析中有較廣泛的應用[2-4]。由于大多數生物分子本身無熒光或熒光較弱，檢測靈敏度較差，人們用強熒光的標記試劑或熒光生成試劑對待測物進行標記或衍生，生成具有高熒光強度的共價或非共價結合的物質，使檢出限大大降低,這就是熒光探針技術。熒光探針的作用有很多，最常用于熒光免疫法中標記抗原或抗體，亦可用于表面活性劑膠束、雙分子膜、多種離子，蛋白質活性位點等微環境特性的探測[5-8]。尤其近年來發展起來的熒光化學傳感器和分子信號系統的應用已深入到藥物學、生理學、環境科學、信息科學等多個領域。目前用于標記或衍生的熒光探針主要有香豆素類、羅丹明類、鄰苯二甲醛類等化合物。

香豆素及其生物應用于染料、醫藥、香料和農藥的文獻已有很多的報道，不過香豆素類衍生物在熒光探針方面的報道在國內還不多見[9-11]。香豆素類化合物是一種具有強烈熒光的化合物，通過內酯結構使二苯乙烯化合物中雙鍵被同定為反式，使得雙鍵的旋轉被阻抑起來，提高其光穩定性，從而使得原來熒光量子效率較低的二苯乙烯化合物轉變為量子效率較高的香豆素化合物，避免了二苯乙烯化合物在紫外光照射下順/反式的相互轉化[12-15]。香豆素類衍生物具有很高的光量子穩定性及光致發光量子效率，因此在國外被廣泛應用于熒光探針的檢測。

1 香豆素類單胺氧化酶（MAO）的熒光探針

單胺氧化酶（Monoamine oxidase,MAO）是機體內參與胺類物質代謝的主要酶類，位于線粒體外膜質，分為MAO-A和MAO-B兩種類型。單胺類物質在機體內具有重要的生理功能，單胺氧化酶的活性異?？梢饳C體多種功能障礙，形成疾病狀態，如帕金森氏病、老年癡呆癥及近年來都市中較為流行的抑郁癥等均與MAO活性異常有關[16-18]。2004年Chen等[19]對香豆素類衍生物進行了改進，合成了具有檢測MAO生物活性的熒光探針，機理見Scheme 1。他們合成了1，3，5探針，發現在MAO的作用下都生成了具有熒光性質的化合物2，4，6（Scheme 2）。

2008年陸優優等[20]利用香豆素衍生物設計了又一種簡便有效的MAO探針，首先引入側鏈基團使得香豆素的熒光猝滅 （Scheme 3），然后在MAO的作用下，該側鏈基團脫掉，使得原來被猝滅的熒光又恢復。該探針設計簡便，容易操作，因而被廣泛應用于單胺氧化酶的檢測。

2 香豆素類β-內酰胺酶基因探針

β-內酰胺酶是細菌體內酶系的一種，他對于盤尼西林以及其它的內酰胺類抗生素具有很高的催化效率，可以給予細菌對于該類藥物的抗藥性，那么對于該類基因是否在于細菌體內表達，Gao Wenzhong等[21]利用香豆素類衍生物設計了如下探針（Scheme 4），首先合成探針CC1和CC2，如果細菌體內該基因表達了β-內酰胺酶，那么β-內酰胺酶就會使得與香豆素相連的側連基團斷裂，這時就會有很強的熒光產生。通過熒光的產生與否就能判斷該細菌體內的β-內酰胺酶基因是否表達。

3 香豆素類過氧化氫熒光探針

過氧化氫是一個重要的活性氧（ROS）因子，存在活的生物體的器官中，其穩態可以有不同的生理和病理的結果，過氧化氫和其他活性氧氧化劑之間的平衡與許多疾病有關病比如癌癥心血管的混亂和阿爾茨海默氏癥及相關的神經退行性疾病。另一方面，有新的證據顯示過氧化氫可能在細胞信號轉換過程中作為第二信使。Nobuaki Soh等[22]設計了香豆素類的H2O2探針DPPEA-HC(Scheme 5)，該探針受其它活性氧因子干擾少，專一性強，準確度高。

Albers A E等[23]設計了香豆素類H2O2的FRET（能量共振轉移）探針（Scheme 6），該探針利用能量共振轉移的原理，當環境中H2O2不存時，這是觀察到的是香豆素結構的發射波長。如果環境中有H2O2存在下，使得兩個熒光基團可以相互的靠近，能量發生轉移，香豆素結構的發射波長正好被熒光素基團吸收，熒光素基團再發出一個發射波長，由于光子經過多次轉移能量變弱波長變長，使得能觀察到的激發波長和發射波長位置相距更遠，更容易被檢測，不容易引起計算的偏差，同時該探針還具有很好的選擇性。

Du Lu-pei等[24]利用Click修飾設計了香豆素類H2O2探針 （Scheme 7），該探針巧妙的利用了Click反應修飾了香豆素基團，使其熒光強度更強，并且使其激發波長增加了70 nm，大大增加了Stoke位移，更加有利于觀察和檢測，準確度更高。該探針同樣具有很好的選擇性，且合成材料相對便宜，方法相對簡單，有很好的應用價值。

4 香豆素類的CN離子探針

氰化物在有機合成中是非常有用的試劑。常用來在分子中引入一個氰基，生成有機氰化物，即腈。例如紡織品中常見的腈綸，它的化學名稱是聚丙烯腈。腈通過水解可以生成羧酸；通過還原可以生成胺等，還可以衍生出其它許多的官能團來。

氰化物擁有令人生畏的毒性，其毒性跟CN離子對重金屬離子的超強絡合能力有關。CN離子主要跟細胞色素P450中的金屬離子結合，從而使其失去在呼吸鏈中起到的傳遞電子能力，進而使中毒者死亡。氰化物中毒一般都很迅速。臨床上常用的搶救方法是用硫代硫酸鈉溶液進行靜脈注射，同時使那些尚有意識的病人吸入亞硝酸異戊酯進行血管擴張來克服缺氧。常見的氰化物中毒原因是誤食含氰果仁，比如生桃仁等。Kim Gun-Joong等[25]設計了香豆素類的CN離子探針 （Scheme 8），該探針對CN離子有很好的選擇性，且其檢測最低濃度約為3.0 μmol/L。利用該探針幾乎可以通過肉眼來判別是否有CN離子的存在，因為當環境中有CN離子存在時，該探針的顏色會從淡淡的橘黃色(1)變成粉色(2)。

5 總結

隨著香豆素類化學、合成化學、分子生物學、分子藥理學的發展，可望有更多的香豆素類探針的開發和應用，尋找有效的專一性強的低毒的香豆素類探針已成為疾病監測和藥物開發的新方向。

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Progress on the Coumarins Fluorescent Probe in Detection

LIU Jiang1,ZHANG Xiao-qin1,HAN Jun2,LIU Jun-biao2, HUANG Feng1，MA Bin-bin1,WANG Yu-guang1
(1.College of Biologial and Environmental Engineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310011, China；2.Jiangsu Sevencontinent Green Chemical Co.,Ltd.,Zhangjiagang 215600,China)

Coumarins have higher fluorescence property and its exploitations in fluorescent probe have attracted more and more attention.They were widely applied on Monoamine oxidase,H2O2and β-Lactamase's gene detection.

coumarin;fluorescent probe;monoamine oxidase

1006-4184（2010）09-0027-05

2010-04-29

劉江（1986－），男，浙江江山人，在讀碩士研究生，主要從事生物有機化學的研究。