黃芩苷對小鼠腸道菌群影響的量-時規律觀察

羅海燕 宋姍姍 黃暨生 孫冬梅 劉素香 鄺棗園*

廣東省廣州中醫藥大學基礎醫學院（510006）

人體體表、與外界相通的腔道內存在大量并不致病的微生物群，尤其是腸道內更是寄居著種類繁多的微生物，這些微生物統稱為腸道菌群。這些微生物群對其宿主非但無害，而且有益，具有促進營養吸收、抗衰老、抗腫瘤等眾多的生理效應，這是正常微生物群與其宿主長期共生的進化結果。

根據中醫理論，過量或長期服用苦寒的清熱解毒的中藥將損傷脾胃、耗傷正氣，提出苦寒傷胃理論，邱賽紅等[1]從胃腸運動、肝腎功能和胃腸激素[2]等角度研究了多種苦寒中藥的傷胃內涵。本課題組自2007年開始從腸道微生態角度研究苦寒藥的傷胃機制，我們的研究發現黃連解毒湯在一定濃度下可抑制雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長，顯示一定的抑制益生菌的作用的不良現象。同時，在較低濃度時尚可抑制條件致病菌的生長[3]。而從清熱解毒藥提取的有效成分是否也具有“傷胃”作用則未見報道。

故本研究在前期研究的基礎上，觀察了黃芩苷對腸道四種菌的影響，同時欲觀察其濃度和作用時間對腸道細菌的影響規律，以期為臨床合理使用黃芩苷提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22g，由廣東省實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（粵）2008-0002；實驗動物質量合格證號：粵監證字2008A022。

表1 黃芩苷對小鼠體質量的影響（±s）

表1 黃芩苷對小鼠體質量的影響（±s）

注：※與正常組比較，其中※表示P＜0.05，※※表示P＜0.01

組別 N 第1天 第3天 第6天 第9天 第14天正常組 8 21.38±0.86 24.10±0.55 25.04±0.35 27.65±0.97 29.99±0.73抗生素組 8 20.55±0.87 23.70±0.67 24.53±0.61 25.41±0.93※※ 26.64±1.30※※黃芩苷低劑量 8 20.81±1.14 23.95±1.02 25.20±0.81 27.89±0.88 30.16±0.94黃芩苷中劑量 8 21.11±0.69 23.59±0.64 24.51±0.47 26.24±0.42※ 29.41±0.69黃芩苷高劑量 8 20.91±1.28 23.30±1.13 24.36±0.97 25.49±1.13※※ 27.65±1.04※※

表2 不同處理因素下四種細菌數量變化（±s，N=8）

表2 不同處理因素下四種細菌數量變化（±s，N=8）

注：※與正常組比較，其中※表示P＜0.05，※※表示P＜0.01

分組 3天 6天 9天 14天大腸埃希菌正常組 8.25±0.27 8.16±0.30 8.19±0.07 8.18±0.85林可霉素組 8.43±0.47 8.62±0.59 8.83±0.24※ 9.39±0.16※※黃芩苷低劑量 8.13±0.58 9.39±0.31※※ 9.00±0.44※※ 9.40±0.21※※黃芩苷中劑量 8.35±0.54 7.77±0.50 7.95±0.62 9.10±0.17※※黃芩苷高劑量 9.14±0.72※ 8.87±0.56 9.14±0.20※※ 9.04±0.43※※糞腸球菌正常組 8.48±0.21 8.10±0.52 8.44±0.79 8.45±0.42林可霉素組 8.29±0.61 9.17±0.27 9.50±0.17※※ 9.65±0.14※※黃芩苷低劑量 8.26±0.26 8.56±0.76 7.85±0.16※ 8.18±0.52黃芩苷中劑量 7.44±0.28※※ 6.77±0.49※※ 8.19±0.41 7.73±0.43※※黃芩苷高劑量 7.61±0.34※※ 7.99±0.73 8.61±0.43 9.12±0.30※雙歧桿菌正常組 9.31±0.14 9.26±0.78 9.36±0.08 9.35±0.67林可霉素組 9.04±0.42 8.96±0.31 8.93±0.20※ 8.61±0.29※※黃芩苷低劑量 9.06±0.32 9.23±0.53 9.33±0.15 9.42±0.16黃芩苷中劑量 9.02±0.21 9.26±0.20 9.12±0.27 9.40±0.29黃芩苷高劑量 9.38±0.24 8.96±0.35 8.88±0.36※※ 8.87±0.23※※正常組 9.29±0.22 9.21±0.25 9.25±0.57 9.32±0.36林可霉素組 8.91±0.32 8.72±0.26※ 8.63±0.45※ 8.30±0.55※※黃芩苷低劑量 8.80±0.39 9.25±0.28 9.21±0.13 9.41±0.33黃芩苷中劑量 9.22±0.43 9.30±0.20 8.97±0.11 9.22±0.23黃芩苷高劑量 9.45±0.23 8.69±0.55※※ 8.95±0.13 8.73±0.29※乳酸桿菌

1.1.2 藥物與試劑

鹽酸林可霉素注射液（上海現代哈森藥業有限公司，2mL/支，300mg/mL，國藥準字H41021941）、黃芩苷（純度＞98%，南京青澤醫藥科技開發有限公司）。

1.1.3 培養基

MRSA培養基、BS培養基、糞腸球菌瓊脂、麥康凱培養基、BHI培養基，由青島高科園海博生物技術有限公司出品。

1.1.4 主要設備

YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺、旋轉蒸發儀、AE1-160電子天平、PV-1漩渦混勻器、金花加樣器、PYX-DHS-50×65-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養箱、825-A型厭氧菌培養罐、BX51型熒光明場數碼顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥

取昆明種小鼠，隨機分為5組：正常組、抗生素組、黃芩苷高劑量組、黃芩苷中劑量組和黃芩苷低劑量組。抗生素組，給予鹽酸林可霉素灌胃，120mg/d；黃芩苷高劑量組給予黃芩苷灌胃，100mg/（kg·d）；黃芩苷中劑量組給予黃芩苷灌胃，50mg/（kg·d）；黃芩苷低劑量組給與黃芩苷灌胃，25mg/（kg·d），正常組給予生理鹽水灌胃，0.4mL/d。每晚8時后禁食，次日9時灌胃后供給足量飼料。

1.2.2 形態行為觀察

每天觀察和記錄各組小鼠外形、活動、飲食、排便情況，實驗進行第1、3、6、9、14天稱量和記錄小鼠體質量。

1.2.3 腸道菌群分析

每組于第3、6、9、14天取8只將小鼠斷椎處死，常規消毒后正中剪開腹腔，找出回盲部，無菌手法取出盲腸內容物涂于潔凈玻片上，革蘭染色后鏡檢計數球菌和桿菌的比例，另取盲腸內容物0.1g，置于裝有玻璃珠的無菌試管內，加0.9mL生理鹽水，于震蕩器上震蕩15min，使盲腸內容物均質化。將上述震蕩好的標本進行10倍系列稀釋至106。選用10-4、10-5、10-6，以滅菌吸頭，自高稀釋度向低稀釋度在相應的培養基上各滴加50μL稀釋液，待滴種好的培養基吸干后，放入37℃ 溫箱中培養。其中MRSA培養基（分離乳酸桿菌）厭氧培養48h，BS 培養基（分離雙歧桿菌）厭氧培養72h、腸球菌瓊脂（分離腸球菌）需氧培養24h、麥康凱培養基（分離腸桿菌）需氧培養24h。待菌落長出后，以菌落形態、革蘭染色、生化反應鑒定所需目的菌。培養好的細菌經鑒定后計算每克盲腸內容物中的細菌數量，即CFU/g標本。選擇菌落適中的稀釋度，算出同一稀釋度平均菌落數（X）。

公式：CFU/g標本=X/0.05×稀釋倍數×1/標本重量（g）。結果用常用對數值1gCFU/g表示。

2 結 果

2.1 各組表征變化

正常組小鼠飲食正常，行動活躍，被毛平整光滑，糞便正常。抗生素組小鼠隨著實驗時間增加，攝食量下降，精神萎靡，行動遲緩，被毛無光澤，畏寒扎堆，大便稀濕等表現越來越明顯。高劑量黃芩苷組小鼠攝食量亦下降，行動較遲緩，被毛無光澤，大便稀濕，隨著實驗時間增加，和抗生素組小鼠表征相似。中劑量黃芩苷組，3、6d時和正常組小鼠表征接近，九天組時開始出現攝食量稍下降，行動較遲緩，糞便較稀釋等現象，但變化沒有高劑量黃芩苷組明顯。低劑量黃芩苷組隨著實驗時間的增加小鼠表征無明顯變化，飲食正常，行動活躍，被毛平整光滑，糞便正常。

2.2 體質量變化

抗生素組，高劑量黃芩苷組小鼠體質量增長緩慢，于第9天和第14天時該兩組小鼠體質量均小于正常組，差別有顯著意義（P＜0.01）。低劑量黃芩苷組小鼠體質量和正常組比較，在第9天時體質量少，第14天時和正常組比較無差異，見表1。

2.3 腸道菌群變化

我們分別觀察了4種菌4個時間點的情況，見表2，現分述如下：

2.3.1 大腸桿菌

抗生素組第9、14天出現大腸桿菌升高，4個時間點呈上升趨勢；黃芩苷高劑量第3天開始出現大腸桿菌升高；黃芩苷中劑量第14天大腸桿菌升高；黃芩苷低劑量組第6天開始出現大腸桿菌升高，黃芩苷各組4個間點變化均波動，無明顯上升或降低趨勢，見表2。

2.3.2 糞腸球菌

抗生素組第9、14天出現腸球菌升高，4個間點呈上升趨勢；黃芩苷高劑量第3天開始腸球菌降低，4個間點出現先降后升趨勢，中劑量和低劑量黃芩苷組腸球菌減少，4個間點也是先降后升。

2.3.3 雙歧桿菌

抗生素組第9、14天出現下降，4個間點呈明顯下降趨勢；黃芩苷高劑量組也在第9、14天雙歧桿菌下降，4個間點呈明顯下降趨勢；黃芩苷中、低劑量組雙歧桿菌與正常組比較差別無統計學意義，4個間點呈波動。

2.3.4 乳酸桿菌

抗生素組第9、14天出現乳酸桿菌下降；黃芩苷高劑量第6天出現乳酸桿菌下降，4個間點波動；中、低劑量黃芩苷對乳酸桿菌無影響，4個間點變化波動。

綜上所述，我們可以看到林可霉素對各種菌的影響變化比較有規律，均在第9和14天出現變化，出現乳酸桿菌和雙歧桿菌減少，大腸桿菌和腸球菌增加，4個間點的變化規律也較明顯，大腸桿菌和腸球菌呈上升趨勢，乳酸桿菌和雙歧桿菌呈下降趨勢。黃芩苷對各種菌的影響變化則較復雜，出現變化的時間點有些提前到第3天，有些推遲到第14天，中、低劑量黃芩苷對乳酸桿菌和雙歧桿菌無影響，但可升高大腸桿菌含量，降低糞腸球菌含量，高劑量黃芩苷可降低雙歧桿菌和乳酸桿菌含量，升高大腸桿菌，降低糞腸球菌。黃芩苷對腸球菌的影響與林可霉素恰好相反。

4個間點的變化除腸球菌出現先降后升外，其他各組均較波動，無明顯的上升或下降趨勢。

3 討 論

本研究顯示林可霉素造成的菌群失調，主要出現在用藥的第9和14天，出現益生菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的下降，大腸桿菌和腸球菌的升高，出現了典型的菌群失調現象，且菌群的變化有明顯的量-時規律，說明該藥可以作為良好的菌群失調模型和對照。

黃芩苷高劑量組也出現益生菌的減少，說明清熱解毒藥黃芩的提取物在一定濃度也會造成菌群失調，其出現菌群失調的時間與林可霉素類似，提示臨床使用該藥劑量和用量的選擇需慎重，也說明黃芩苷可能是黃芩造成菌群失調的物質基礎之一。

有趣的研究結果是，與黃連解毒湯的研究[3]類似，我們也觀察到黃芩苷在中、低劑量使用時出現條件致病菌糞腸球菌的減少，這點與林可霉素不一致（林可霉素可使糞腸球菌升高）。腸球菌屬目前被認為是醫院感染的常見致病菌，通常引起尿道感染、傷口感染、菌血癥等，主要見于免疫力低下或過量使用抗生素的患者[4]，也可導致敗血癥、心內膜炎等危及生命，病死率達21.0%～27.5%[5]。腸球菌種類很多，其中糞腸球菌最為常見。本研究發現一定濃度的黃芩苷可抑制糞腸球菌的生長，提示黃芩苷可能在治療糞腸球菌感染中起到一定作用。

[1]邱賽紅,李飛艷,尹健康等.9味苦寒藥對小鼠胃腸運動與肝腎功能影響的實驗研究[J].湖南中醫學院學報,2004,24(5)：1-6.

[2]李飛艷,邱賽紅,尹健康等.常用苦寒藥對大鼠胃腸激素影響的研究[J].湖南中醫學院學報,2007,27(1)：9-11.

[3]羅海華,董姝,張晟等.黃連解毒湯對小鼠腸道菌群的影響[J].熱帶醫學雜志,2009,9(4)：367-371.

[4]Olesen HV,Moller JK.Enterococcal infection： clinical findings and treatment considering antibiotic resistance in Denmar[J].Ugeskr Laeger,2002,163(18)：2386-2390.

[5]Sanchez-silos RM,Perez-Giraldo C.Pathogenicity of enterococcus spp. Characteristics of 169 hospital isolates[J].Enferm Infection Microbiol Clin,2000,18(4)：165-169.