EGFP基因在不同細胞中的轉染效率

徐貴江 張 明 任麗偉 洪菊生 李國慶

1 揚州市婦幼保健醫院（225002）

2 揚州大學動物科學與技術學院（225002）

目前，基因療法在醫學領域掀起了研究熱潮。然而，實施基因治療的前提是將功能基因導入需要接受治療的靶器官或靶組織的細胞中，讓功能基因表達產生能夠消除或減輕疾病癥狀的物質。

對此，基因轉染研究就顯得尤為重要?；蜣D染方法眾多，如磷酸鈣法、電穿孔法、陽離子脂質體法、病毒介導法和顯微注射法等。不同的轉染方法、不同的細胞系轉染效率不盡相同。本研究采用EGFP報告基因轉染AAV-293、NIH-3T3、CEF 3種細胞，旨在比較3種細胞用于基因轉染時效率的高低。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

E.coliDH5a菌株、pEGFP-C1質粒、雞胚成纖維細胞（CEF）均由揚州大學動物科學與技術學院分子實驗室提供；AAV-293和NIH-3T3細胞株為作者醫院保存。

1.2 主要儀器和設備

超凈臺；CO2培養箱；熒光倒置顯微鏡；電子天平；離心機；水浴鍋，電熱恒溫板等。

1.3 主要試劑

高糖DMEM培養液、胰蛋白酶、聚乙烯亞胺（PEI）購自 Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；質粒小量抽提試劑盒購自（大連）Takara 公司。

1.4 質粒的小量抽提

將含有質粒pEGFP-N1的E.coliDH5а培養過夜，次日使用質粒小量抽提試劑盒抽提質粒pEGFP-N1。

1.5 質粒的純化與消毒

將抽提的質粒pEGFP-N1進行去內毒素純化處理，用2倍體積的無水乙醇沉淀提取質粒，具體方法步驟見參考文獻[1]。75%乙醇洗滌質粒沉淀進行滅菌處理，在無菌條件下晾干后，溶解于5%葡萄糖溶液中。

1.6 質粒的濃度及純度測定

使用核酸濃度及純度分析儀測定純化的質粒pEGFP-N1。

1.7 PEI介導質粒轉染細胞

將AAV-293、NIH-3T3、CEF 3種細胞在含10% FBS的DMEM培養液中培養，待生長至90%匯合度時，用0.25%胰蛋白酶溶液消化分散細胞，將分散的細胞懸液接種于6孔細胞培養板，濃度為1×105個細胞/孔，然后于37℃，5% CO2培養箱中培養，當細胞生長至80% 匯合度時，吸除細胞培養液，細胞用預熱至37℃的PBS緩沖液洗滌3次后，將PEI包裹的純化好的質粒pEGFP-N1加入每板孔中，于CO2培養箱中孵育3h后，改換含10%FBS的完全培養基，繼續培養48h后，觀察結果。

1.8 轉染效率的評定

轉染48h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP在細胞的表達，分析轉染效率。

2 試驗結果與分析

2.1 質粒的濃度及純度測定

核酸濃度及純度測定結果表明，純化后質粒pEGFP-N1的濃度約為1μg/μL，且OD260/280=1.83說明質粒的純度很好，可以用來轉染細胞。

2.2 質粒轉染細胞的觀察結果

轉染48h后，于熒光倒置顯微鏡下觀察，結果表明，EGFP基因轉染AAV-293、NIH-3T3、CEF 3種細胞后，都可觀察到綠色熒光（圖1）。

2.3 評定轉染效率

通過觀察分析熒光強度及綠色熒光細胞數，比較轉染效率表明，EGFP基因在NIH-3T3細胞中的轉染效率最高，其次是AAV-293細胞，CEF細胞中較低。

3 討 論

本研究采用的是陽離子聚合物聚乙烯亞胺（PEI）介導基因轉染的方法[2]。PEI的相對分子量為25×103，是一種有機高分子聚合物，具有較高的陽離子電荷密度，能形成高度分枝，每相隔二個碳個原子，即：每第3個原子都是質子化的氨基氮原子，使得聚合物網絡在任何pH下都能充當有效的“質子海綿”體，從而將DNA 網于其中，這種多聚陽離子能將各種基因轉入各種種屬細胞，其轉染效果好，而且細胞毒性低[3,4]。因此PEI 作為DNA的轉染劑可有效用于體內和體外的基因轉染。

本研究采用增強型綠色熒光蛋白[5-9]（EGFP）基因轉染細胞。在評定轉染效率時，只需用肉眼在熒光顯微鏡下通過分析熒光強度及熒光細胞數目就可直觀地判定轉染效率的高低。

圖1 pEGFP-N1質粒轉染細胞AAV-293、NIH-3T3、CEF

近些年來基因治療有成功的案例，但更多的是在總結教訓，是一個喜憂參半的全新領域?；虔煼ㄊ〉母驹蛟谟?，功能基因在需要接受治療的靶器官或靶組織的細胞中轉染效率不高，絕大多數基因尚未表達產物時，就被機體清除。本研究表明，在實施基因治療時，不妨先看看功能基因在靶細胞上的轉染效率，以為后期基因治療的成功奠定基礎。

[1]張泉,袁燕,袁維峰等.動物用質粒DNA內毒素去除方法的建立及其質量檢驗[J].中國獸醫學報,2009,29(1)： 63-66.

[2]Boussif O,Lezoualc' HF,Zanta MA,et al.A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo：polyethylenimine[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(16)： 7297-7301.

[3]高波,謝飛,宋成義等.聚乙烯亞胺及睡美人轉座酶對基因免疫效果的影響[J].中國獸醫雜志,2008,44(12)： 15-17.

[4]王宇光,鄭建華,趙璐等.聚乙烯亞胺介導的報告基因在體外轉染效率的研究[J].哈爾濱醫科大學學報,2004,38(5)： 426-428.

[5]Rosochacki SJ,Matejczyk M.Green fl uorescent protein as a molecular marker in microbiology[J].Acta Microbiol Pol,2002,51(3)：205-216.

[6]何海健,陳婷飛.綠色熒光蛋白及其在分子生物學上的應用[J].金華職業技術學院學報,2008,8(4)： 26-30.

[7]徐飛虎,龔興國.綠色熒光蛋白應用研究進展[J].細胞生物學雜志,2002,24(6)： 332-334.

[8]趙培,張俊龍.漫談綠色熒光蛋白——2008年度諾貝爾化學獎[J].大學化學,2008,23(6)： 1-6.

[9]楊軍,陳曉黎,蘇寶山等.增強型綠色熒光蛋白標記的Hela細胞株的建立[J].西安交通大學學報(醫學版),2008,29(6)： 717-720.