替硝唑注射液細菌內毒素檢查法的可行性研究

焦小麗 黃新蘭* 季紅蘭 陳琴華

江蘇省揚子江藥業集團有限公司（225321）

替硝唑注射液為抗厭氧菌及滅滴蟲藥，臨床主要用于治療滴蟲、腸及腸外阿米巴病、賈第蟲病和厭氧菌感染。替硝唑注射液在《中國藥典》2005 版中采用家兔法檢查熱原[1]，但家兔法操作繁瑣費時，而且實驗成本高，不適用于注射劑生產過程中的質量監控。本實驗根據鱟試劑在沒有干擾條件下可以對樣品進行細菌內毒素檢查的原理，參照《中國藥典》2005 版中的細菌內毒素檢查法，采用凝膠法鱟試驗法，通過干擾實驗確立了替硝唑注射液的細菌內毒素檢查法，并與家兔法進行對照，實驗結果表明細菌內毒素檢查法準確可靠、操作方便簡單，可以用細菌內毒素檢查法代替家兔法控制替硝唑注射液的熱原[2]。

1 儀器與試藥

2H-2型漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；TAL-3A型干式恒溫器（南京三愛斯技術開發有限公司）；LC-233B1型高溫干燥箱。細菌內毒素標準品（批號為150601-200862，120EU/支，中國藥品生物制品檢定所）。鱟試劑（TAL，批號為0810222，0.25EU/支，0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司；批號為0809200，0.25EU/支，0.1mL/支，湛江博康海洋生物有限公司）。細菌內毒素檢查用水（BET水，批號為0806300，25mL/瓶，湛江安度斯生物有限公司）；熱原合格的替硝唑注射液（規格：200mL：0.8g，批號：08090611、08090811、08090911揚子江藥業集團南京海陵藥業有限公司）。

2 方法與結果[3-13]

2.1 細菌內毒素限值L確定

公式L=K/M中L為細菌內毒素限值；K為按規定的給藥途徑，人用每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑為5EU/(kgh)[1]；M為每小時內每千克體質量（人）的最大給藥劑量，或熱原檢查家兔按規定給藥途徑的給藥劑量，2005年版《中國藥典》規定家兔劑量為8mL/kg，因此可算得L=5/8=0.625EU/mL。

2.2 最大有效稀釋倍數的確定

根據公式MVD=cL/λ，L為供試品的細菌內毒素限值，c為供試品溶液的濃度，λ為鱟試劑的標示敏感度。2005年版《中國藥典》規定當L以EU/mL表示時，c為1.0mL/mL。L=0.625EU/mL，λ為0.25EU/mL，則MVD=2.5。

2.3 細菌內毒素檢查用水（BET）的質量考察

實驗中使用的細菌內毒素檢查用水（內毒素含量＜0.015EU/mL）經檢查，在37℃試管恒溫儀中放置4h未與鱟試劑產生凝聚反應，符合中國藥典規定[2]。

2.4 TAL敏感度復核

所用TAL按2005年版《中國藥典》規定進行敏感度復核。結果均在0.5～2λ，符合規定，故可用于細菌內毒素的檢查。

2.5 干擾預試驗

選用λ=0.25EU/mL的TAL，以原液作為基準，用BET水對樣品進行倍比稀釋，得樣品的稀釋倍數系列（即原液，1∶2、1∶4、1∶8、1∶16），以此系列為NC系列。PC系列：用原液和供試品各稀釋液將細菌內毒素標準品稀釋成與上述NC系列相同的稀釋倍數系列，但在稀釋過程中每稀釋倍數中都會有2λ內毒素。選擇兩個廠家的標示量為0.25EU/mL的TAL，使之分別與上述兩個系列反應，同時作陽性對照和陰性對照，結果見表1。結果表明：樣品溶液稀釋倍數在1∶2以下時不干擾試驗。

2.6 干擾試驗

采用兩個廠家0.25EU/mL的TAL，用替硝唑液注射液的1∶2稀釋液和BET水將同一細菌內毒素工作標準品分別制成2.0、1.0、0.5、0.25λ的系列濃度溶液，考察本品對細菌內毒素檢查法的干擾情況，結果見表2。Es值在0.5～2.0λ，且Et值在0.5Es～2.0Es，說明此時樣品稀釋對細菌內毒素檢查無干擾。

表1 供試品干擾試驗預試驗結果

表2 供試品的干擾試驗結果

表3 3批替硝唑注射液的細菌內毒素檢查結果

2.7 樣品中細菌內毒素檢查

按2005年版《中國藥典（二部）》附錄規定的方法，對3批樣品按1∶2稀釋后，以λ為0.25EU/mL的TAL進行常規的細菌內毒素檢查，結果見表3。結果表明，3批替硝唑注射液的細菌內毒素均小于0.5EU/mL，與熱原法結果一致。

3 討 論

本試驗采用不同廠家的TAL對3個批號樣品進行凝膠法細菌內毒素檢查，結果符合2005年版《中國藥典》附錄有關規定，排除了采用了不同廠家TAL對本試驗帶來的影響，且供試品用熱原檢查法檢測也均符合規定。因此，可認為用細菌內毒素檢查法檢測替硝唑注射液中的細菌內毒素是可行的，并可確定其細菌內毒素限值為0.5EU/mL。

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