高效液相色譜法測(cè)定紅曲中洛伐他汀的含量

杜珊

（博福-益普生（天津）制藥有限公司，天津 300384）

高效液相色譜法測(cè)定紅曲中洛伐他汀的含量

杜珊

（博福-益普生（天津）制藥有限公司，天津 300384）

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定紅曲中洛伐他汀含量的方法。方法：采用色譜柱AgilentZORBAXSB-C18(4.6×150mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.02%磷酸（75：25），流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為237nm。結(jié)果：洛伐他汀在1.1936-3.5808μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（γ=1），平均回收率為100.78%，RSD為1.40%。結(jié)論：本方法靈敏、準(zhǔn)確，可作為紅曲的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜；紅曲；洛伐他汀

紅曲系通過(guò)現(xiàn)代生物工程技術(shù)分離出優(yōu)質(zhì)的紅曲霉菌，經(jīng)固體深層發(fā)酵精制而成一種純天然綠色產(chǎn)品。本品性狀為淡紅色粉末，色調(diào)純正，光熱穩(wěn)定性好，純天然，安全無(wú)副作用，pH適用范圍廣，具有降血脂、血壓、膽固醇、調(diào)節(jié)人體心腦血管健康、提高人體免疫力的醫(yī)療保健功效。近年來(lái)紅曲霉的次級(jí)代謝物成為研究熱點(diǎn)，從紅曲中分離出優(yōu)良的降血脂藥物洛伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶的抑制劑，這類(lèi)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中都有一個(gè)類(lèi)似于HMG-COA的基團(tuán)，其作用機(jī)理可能是通過(guò)對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)達(dá)到抑制酶的催化活性，從而具有顯著的降血脂作用。本文進(jìn)行了HPLC法測(cè)定紅曲中洛伐他汀的研究，確定了最佳色譜條件和簡(jiǎn)便有效的樣品處理方法，為紅曲相關(guān)產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Waters2695SeperationsModule;Waters 717 Plus Auto Sample;Empower色譜工作站；Waters2487 Dual λ Absorbance Detercter。

超聲清洗機(jī)：奧特塞恩斯 AS3120（120W、40KHz）（天津技術(shù)有限公司）。

天平：梅特勒－托利多AL204型電子分析天平。

1.2 試劑

甲醇：色譜純（天津康科德科技有限公司）。

磷酸：分析純（天津化學(xué)試劑三廠）。

洛伐他汀對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所（100600-200502）。

無(wú)水乙醇：分析純（天津化學(xué)試劑二廠批號(hào)：20071204）。

2 實(shí)驗(yàn)條件的篩選

2.1 因素水平表

表1 因素水平表

2.2 正交實(shí)驗(yàn)表

表2 正交試驗(yàn)表

2.3 結(jié)論

從以上正交表的極差來(lái)看，B>A>C>D。即：影響此試驗(yàn)結(jié)果的最大因素為稱樣量。根據(jù)此數(shù)據(jù)分析所篩選出的最佳方案為A2B3C2，即用75%的乙醇為溶劑稱樣量為0.3g，超聲30min為最佳方案。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜分析條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×150mm，5μm)SN：USCM017738

流速：1.0mL/min；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：20μL；

流動(dòng)相：甲醇-0.02%磷酸（75：25）；

檢測(cè)波長(zhǎng)：237nm

3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取洛伐他汀對(duì)照品14.92mg，置于50mL量瓶中，用75%乙醇溶解，定容，制成濃度為298.4mg/L的對(duì)照品溶液作為加樣回收率的對(duì)照品；精密量取300mg/L的對(duì)照品溶液10mL，置于25mL容量瓶中，制成濃度為119.36mg/L的對(duì)照品溶液作為對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

精密稱取紅曲樣品0.3g，置10mL量瓶中，加入75%乙醇溶液，超聲30min，放冷，定容，過(guò)0.45μm的濾膜，取續(xù)濾液，即得。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取298.4mg/L的對(duì)照品溶液，分別精密吸取2mL、3mL、10mL、5mL、15mL 于 10mL、10mL、25mL、10mL、25mL量瓶中，分別制成濃度為59.68mg/L、89.52 mg/L、119.36 mg/L、149.2 mg/L、179.04 mg/L的對(duì)照品溶液，分別取20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)表明：洛伐他汀含量在1.1936～3.5808μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為γ=1，直線回歸方程為y=3×106x-71635。

3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取119.36mg/L對(duì)照品溶液，按上述液相色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算出各峰面積RSD值為1.27%，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果洛伐他汀平均含量的RSD值為0.76%，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液室溫下放置，于第0、2、4、6、8、12h依次測(cè)定洛伐他汀含量，結(jié)果洛伐他汀含量的RSD值為0.81%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品的穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別稱取供試品約0.15g，精密稱定，置于10mg容量瓶中，分別加入298.4mg/L對(duì)照品溶液各5ml，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，在所述的色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 洛伐他汀回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.9 樣品測(cè)定

取三批紅曲按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖及面積，計(jì)算樣品含量，結(jié)果為20070701含7.95 mg·g-1、20071101含 8.24 mg·g-1、20080201 含 8.23 mg·g-1。

4 討論

應(yīng)用高效液相色譜法作定量分析，前處理是一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。據(jù)報(bào)道[3]，洛伐他汀含量測(cè)定多用甲醇或乙醇超聲提取。本文也對(duì)溶劑以及超聲時(shí)間做了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用75%乙醇超聲30min，可較完全提取紅曲中的洛伐他汀，方法學(xué)驗(yàn)證說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，新配制的洛伐他汀對(duì)照品溶液只有一個(gè)吸收峰，是酯式的洛伐他汀。但室溫下放置過(guò)夜后，再次測(cè)定時(shí)會(huì)出現(xiàn)2個(gè)吸收峰。因此建議試驗(yàn)時(shí)洛伐他汀對(duì)照品溶液及樣品溶液均應(yīng)新鮮配制。

［1］王春娜.HPLC法檢測(cè)功能紅曲中的洛伐他汀[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào).2000,15(2):48-51.

［2］黃宏南.RP-HPLC法分離測(cè)定紅曲中洛伐他汀[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志.2000,6(4):40-41.

Determination of lovastatin in red koji by HPLC

DU Shan
(Beaufour-Ipsen(Tianjin)Pharmaceutical CO.,LTD.,Tianjin 300384)

To establish a method for determination of Lovastatin in red koji.METHODS：ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm,5μm)column was used and the mobile phase was methanol-0.02%phosphoric acid (75:25).The detection wavelength was at 237nm,the flow rate was 1.0mL/min.RESULTS：The linear range was obtained between 1.1936-3.5808μg（γ=1）and the average recovery was 100.78%，with relative standard deviation(RSD)of 1.40%.CONCLUSION：This method is convenient,rapid and is suitable for determination of lovastatin in red koji.

HPLC;red koji;lovastatin

10.3969/j.issn.1008-1267.2010.03.019

O657.7+2

A

1008-1267（2010）03-053-03

2009-10-28