黃芪對(duì)肝纖維化的防治作用

王登妮 ，徐軍全 *，宋維芳 ，張曉陽 ，王明亮 ，梁永剛

（1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院科技中心，山西汾陽 032200；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科，天津 300211）

在抗肝纖維化的眾多藥物中，中藥黃芪及其復(fù)方制劑是一類有很大發(fā)展?jié)摿Φ乃幬铩Ｒ酝膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪具有抑制肝組織膠原沉積和防治肝纖維化的作用，還可改善肝臟微循環(huán)，增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，促進(jìn)肝再生。然而有關(guān)其抗肝纖維化的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。內(nèi)毒素可激活肝枯否細(xì)胞（Kupffer cell，KC）合成與釋放細(xì)胞因子（cytokine）和炎癥介質(zhì)，并在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮作用，內(nèi)毒素通過誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生[1]，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增殖和分化，使細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）產(chǎn)生增多。本研究通過觀察黃芪對(duì)慢性肝纖維化過程中血漿內(nèi)毒素水平的影響及意義，進(jìn)一步探討黃芪防治肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及材料

健康清潔級(jí)雌性 Wistar大鼠，體重（230±20）g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；四氯化碳（CCl4）為中國中邦化工分析純；鱟試劑盒購自上海伊華醫(yī)學(xué)科技公司，天狼猩紅、固綠FCF、羥脯氨酸（HYP）標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；黃芪注射液（成都地奧九鴻制藥廠），丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所第一分所），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 30只Wistar大鼠飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為三組，A組（正常對(duì)照組）、B組（模型組6周）、C組（黃芪處理組6周）。

1.2.2 造模 A組不給予處理，其他兩組給予首劑5 ml/kg體重皮下注射CCl4分析純，然后按3 ml/kg體重皮下注射40%CCl4植物油（V/V）混合液，每周2次。C組于造模同時(shí)給予皮下注射黃芪注射液[800 mg/（kg·d）][2]。

1.2.3 取材 在無菌無熱源條件下，從大鼠腹主動(dòng)脈采血，注入加有肝素的無熱源玻璃試管中，離心取血漿置于玻璃試管中封口，低溫保存。取新鮮肝左葉一部分立即固定于4%多聚甲醛中，24 h內(nèi)石蠟包埋；一部分于-80℃保存。

1.2.4 染色 行常規(guī)HE染色。

1.2.5 天狼猩紅膠原染色 組織切片用天狼猩紅染液室溫孵育60 min，中性樹膠封片，顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.6 肝組織HYP含量測(cè)定 取凍存肝組織約0.2 g消化，取肝臟消化液1.0 ml，對(duì)照管為1.0 ml去離子水，然后依次加入:①0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 6.0）0.5 ml和 0.05 mol/L氯胺T溶液1.0 ml，37℃水浴 25 min；②3.15 mol/L過氯酸溶液1.0 ml，室溫下作用5 min；③10%對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液1.0 ml，100℃沸水 5 min；④冰浴冷卻，測(cè)定 560nm處吸光度。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，在HYP標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得待測(cè)肝組織HYP含量。

1.2.7 產(chǎn)色基質(zhì)偶氮法鱟試劑測(cè)定血漿內(nèi)毒素 參照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況及造模效果

實(shí)驗(yàn)過程中，正常對(duì)照組大鼠健康狀況良好，肝臟表面光滑，顏色紅潤(rùn)；模型組大鼠的活動(dòng)及攝食減少，精神萎靡，體重下降，皮毛雜亂無光澤，肝臟表面不光滑，顏色灰暗，體積變大，邊緣圓鈍，肝組織 HYP含量和肝FI明顯升高；黃芪處理組大鼠癥狀比模型組輕，體重下降比較慢，肝組織HYP含量和肝FI比模型組降低，結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血漿ET、ALT及肝組織MDA、Hyp、FI的變化（±s）

表1 各組大鼠血漿ET、ALT及肝組織MDA、Hyp、FI的變化（±s）

與正常對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

組別 n HYP（mg/g） FI（%） ET（Eu/ml） ALT（U/L） MDA（nmol/mg肝臟）正常對(duì)照組模型組黃芪處理組5780.30±0.030.77±0.06a 0.66±0.06ab 0.33±0.142.18±0.71a 1.24±0.40ab 0.08±0.010.55±0.07a 0.42±0.03ab 44.96±8.26156.36±13.17a 127.41±12.10ab 0.17±0.031.41±0.06a 1.08±0.07ab

2.2 HE染色

正常對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞大小均勻，無變性、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)存在，小葉內(nèi)肝細(xì)胞索排列整齊；模型組肝細(xì)胞可見明顯脂肪變性，匯管區(qū)纖維組織明顯增生；黃芪處理組纖維組織增生不明顯（圖1）。

2.3 膠原染色

顯微鏡下重點(diǎn)觀察紅色膠原纖維分布情況。正常對(duì)照組僅于血管周圍見少量紅色纖維；模型組肝組織中紅色纖維明顯增多，由匯管區(qū)和中央靜脈向肝小葉內(nèi)伸展分隔，相互連接形成較粗大的纖維間隔；黃芪處理組見較細(xì)的紅色纖維走行于血管周圍，數(shù)量較正常對(duì)照組稍多（圖2）。

2.4 黃芪對(duì)血漿內(nèi)毒素、ALT和肝組織MDA變化的影響

黃芪處理組與模型組比較，血漿內(nèi)毒素、ALT和肝組織MDA均明顯降低，結(jié)果見表1。

3 討論

研究顯示，血漿內(nèi)毒素水平在肝纖維化過程中逐漸升高，提示腸源性內(nèi)毒素血癥在肝纖維化發(fā)生及發(fā)展中起重要作用[3-4]。內(nèi)毒素通過誘導(dǎo)TNF-α和IL-1[5]產(chǎn)生，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增殖和分化，使細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）產(chǎn)生增多。降低血漿內(nèi)毒素水平可阻斷上述途徑，逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

目前，治療肝纖維化是防治慢性肝病發(fā)展為肝硬化的重要手段，尋找有效抗肝纖維化的藥物是研究熱點(diǎn)，在抗肝纖維化的眾多藥物中，中藥黃芪及其復(fù)方制劑是一類有很大發(fā)展?jié)摿Φ乃幬铩｜S芪能夠減少免疫損傷所致肝內(nèi)膠原成分的異常沉積，對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化有明顯的治療作用，且隨著療程的延長(zhǎng)，其作用有所增強(qiáng)[6-7]。黃芪注射液的主要成分是黃芪總黃酮、黃芪總皂苷和黃芪多糖，具有益氣養(yǎng)心、扶正祛邪的功效。張銀娣等[8]研究了黃芪皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用，證實(shí)黃芪可保護(hù)肝細(xì)胞膜，降低血清ALT、AST水平。MDA是一種脂質(zhì)過氧化物，其組織中的含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[9]。肝纖維化的形成有多種細(xì)胞因素的參與，與氧自由基、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等密切相關(guān)[10]。有研究報(bào)道黃芪有抗脂質(zhì)過氧化、抗氧自由基的作用[11]。張弢等[12]的研究提示復(fù)方黃芪顆粒可以在蛋白水平增強(qiáng)MMP-2酶蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制TIMP-2酶蛋白的表達(dá)，促進(jìn)ECM的降解，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的目的。然而黃芪防治肝纖維化的作用機(jī)制尚不很清楚。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芪抗肝纖維化的機(jī)制進(jìn)行了初步研究，筆者通過觀察黃芪對(duì)肝纖維化過程中血漿內(nèi)毒素水平的影響來探討黃芪抗肝纖維化的作用機(jī)制。從肝組織病理學(xué)、HYP含量和肝FI方面證實(shí)黃芪可以防治CCl4所致的肝纖維化；黃芪在抑制大鼠肝纖維化過程中，可降低血漿內(nèi)毒素水平，使肝纖維化程度減輕。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到黃芪在防治肝纖維化過程中可以降低血清ALT、肝組織MDA等水平，發(fā)揮抗肝纖維化作用。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)黃芪的抗肝纖維化可能與其減緩腸源性內(nèi)毒素血癥有關(guān)。黃芪對(duì)內(nèi)毒素的下游傳導(dǎo)通路是否有影響有待進(jìn)一步研究。

[1]Uesugi T,Froh M,Arteel GE,et al.Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice [J].Hepatology,2001,34(1):101-108.

[2]周賢,戴立里,賈麗萍,等.黃芪注射液對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的防治[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,30(1):50-52.

[3]李紅,韓德五.內(nèi)毒素血癥在大鼠肝硬化發(fā)生發(fā)展中的作用[J].中國病理生理雜志,2001,17(4):353-355.

[4]李保文,張?zhí)m,呂增華.黃芪對(duì)阻塞性黃疸幼鼠血清和肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1水平的影響[J].濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,(4):241-243.

[5]Nomura F,Akashi S,Sakao Y,et al.Cutting edge:endotoxin tolerance in mouse peritoneal macrophages correlates with down-regulation of surface toll-like receptor 4 expression[J].J Immunol,2000,164(7):3476-3479.

[6]馬紅,王寶恩.黃芪對(duì)免疫損傷性肝纖維化大鼠的治療作用[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,1997,7(1):32-35.

[7]馬桂鳳,王莉,季萬剩,等.黃芪注射液對(duì)肝纖維化大鼠模型肝細(xì)胞膠原及TGF-1表達(dá)的影響[J].濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,6(29):535-536.

[8]張銀娣,沈建平.黃芪皂苷抗實(shí)驗(yàn)性肝損傷作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1992,27(6):401-406.

[9]羅瑞虹.肝纖維化的血清學(xué)診斷[J].國外醫(yī)學(xué):內(nèi)科學(xué)分冊(cè),1999,26(5):208-210,217.

[10]Greenwel P,Dominguez-Rosales JA,Mavi G,et al.Hydrogen peroxide:a link between acetaldehyde-elicited alpha1(I)collagen gene up-regulation and oxidative stress in mouse hepatic stellate cells[J].Hepatology,2000,31(1):109-116.

[11]汪德清,沈文梅.黃芪活性提取成分對(duì)膜脂質(zhì)過氧化損傷的防護(hù)作用[J].中國中藥雜志,1996,21(12):746-748.

[12]張弢,李筠,趙景民,等.復(fù)方黃芪顆粒對(duì)肝纖維化大鼠肝臟基質(zhì)金屬蛋白酶-2、金屬蛋白酶組織抑制因子-2蛋白表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2008,18(4):242-244.